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    影響玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生因素的研究

    2010-09-04 03:00:38王小紅
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:胚性基因型分化

    王小紅

    (南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南通 226006)

    生物技術(shù)的迅速發(fā)展為加快玉米育種進(jìn)程開(kāi)辟了新途徑,玉米體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷取得進(jìn)展。利用玉米不同器官作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究顯得格外重要。研究建立有效的組織培養(yǎng)系統(tǒng),從中獲得大量再生植株是玉米育種工作的首要前提。自1975年Green首次從玉米未成熟胚培養(yǎng)出愈傷組織,并成功地獲得了再生植株以來(lái),玉米幼胚培養(yǎng)技術(shù)有了快速發(fā)展。雖現(xiàn)在幾乎能從玉米各個(gè)部位誘導(dǎo)出愈傷組織,但幼胚是最易誘導(dǎo)也是使用最多的外植體。誘導(dǎo)玉米幼胚產(chǎn)生胚性愈傷組織及胚性愈傷組織分化受諸多因素的影響,包括基因型、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件、幼胚大小等。筆者選用抗性好、適宜本地種植的玉米自交系幼胚進(jìn)行了外植體的愈傷組織誘導(dǎo)研究,旨在建立具有胚性的愈傷組織培養(yǎng)體系,為玉米遺傳轉(zhuǎn)化提供受體材料。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 供試材料為玉米自交系515、齊319、魯原 341、502,海南種植。

    1.1.2 試劑與儀器 抗生素、生長(zhǎng)素、封口膜等購(gòu)于上海生工。烘箱、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、氣候箱等由南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.3 培養(yǎng)基 (1)MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+0.5 g/L Pro、40 g/L 蔗糖、0~2.5 mg/L 2,4-D 、0.5 mg/L氨基苯甲酸、0.5 mg/L泛酸鈣、0.25 mg/L核黃素;(2)MS繼代培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 、0.5 g/L Pro、30 g/L 蔗糖;(3)分化培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖、0~2 mg/L 6-BA ;(4)生根培養(yǎng)基:N 6 培養(yǎng)基+20~30 g/L 冰糖、5 g/L 活性炭、1 mg/L 6-BA 。

    1.2 方法

    1.2.1 幼胚的預(yù)處理 取授粉后11~13 d的玉米果穗,剝?nèi)プ钔鈨蓪影~。用70%乙醇噴灑苞葉表面,然后剝?nèi)訉影~,當(dāng)剩最后一層時(shí),再用70%乙醇噴灑苞葉表面,立刻將果穗轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。去掉苞葉和花絲,用解剖刀削去子粒頂部2/3胚乳,用鑷子從中上部挑出幼胚(幼胚大小最適0.8~2.0 mm)。盾片朝上放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,避光、27℃下誘導(dǎo)出愈傷組織。

    1.2.2 玉米愈傷的繼代培養(yǎng) 誘導(dǎo)出的長(zhǎng)勢(shì)好的愈傷組織夾成2~3 mm大小的塊,在繼代培養(yǎng)基培養(yǎng),約10~12 d繼代一次,進(jìn)行愈傷組織的增殖。培養(yǎng)溫度為28℃,光照10~12 h/d,光照強(qiáng)度800~1 000 Lx,日光燈照明。

    1.2.3 愈傷組織再分化及植株的再生 將抗性的愈傷挑入分化培養(yǎng)基中光照培養(yǎng),再生植株。當(dāng)再生苗在三角瓶中長(zhǎng)到6~9 cm高時(shí),將其移到小的花盆中(下層為滅菌的壤土,上層為蛭石),每天澆l/10 MS營(yíng)養(yǎng)液,并套袋保濕,在大棚中培養(yǎng)10 d左右,移栽到土壤中。

    1.2.4 影響愈傷組織誘導(dǎo)的各因素 (1)胚齡和基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響:分別取授粉后8、9、10、11、12、13 d(海南地區(qū)夏播)的玉米幼胚,幼胚長(zhǎng)度約在1~3 mm左右,基因型分別為齊319、515、魯原 341、502,在加有 0.5 m g/L 2,4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng),在20 d左右統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率,并對(duì)胚齡和基因型兩因素進(jìn)行隨機(jī)試驗(yàn)方差分析。(2)2,4-D濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響:取授粉10 d的齊319、魯原34的玉米幼胚,在 2,4-D 濃度為:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng),25 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織塊數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素

    2.1.1 胚齡對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 如表1所示,胚齡9 d的魯原341胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,可以達(dá)到98.5%,其他基因型授粉10 d左右的幼胚最高。13 d的幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率很低,最高的齊319也只有76.8%。從表1可以看出,10 d胚齡的幼胚誘導(dǎo)率最高,平均達(dá)到88.09%,13 d的最低,平均只有65.90%。胚齡對(duì)于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率差異比較顯著。從技術(shù)的可操作性和培養(yǎng)性狀來(lái)講,10 d左右的幼胚一般在1.2~1.5 mm左右,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高,幼胚容易從雌穗上剝離,實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)。胚齡較大的幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上容易萌發(fā),誘導(dǎo)出的愈傷組織發(fā)粘、胚性差、不易繼代。

    表1 不同基因型玉米幼胚不同生長(zhǎng)天數(shù)下的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率 (%)

    2.1.2 基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 從表1的數(shù)據(jù)和分析中可以看出齊319的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率平均最高,達(dá)到87.08%,502的最低,只有61.44%。其中502誘導(dǎo)出的愈傷組織大部分發(fā)粘,H型胚性愈傷組織少,不易繼代培養(yǎng);齊319與魯原341誘導(dǎo)的H型愈傷組織多,松脆,淡黃色,胚性好。說(shuō)明不同的基因型在相同2,4-D濃度的培養(yǎng)基上誘導(dǎo),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著差異,由此看出基因型是影響玉米遺傳轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要因素。

    2.1.3 2,4-D濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效,在組織培養(yǎng)中一般用其作為培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)激素。培養(yǎng)基中2,4-D的濃度對(duì)玉米愈傷組織的誘導(dǎo)影響極大。如表2所示,齊319在1.0 m濃度上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,達(dá)到97.8%,而魯原341在0.5 mg/L上誘導(dǎo)率最高,達(dá)到98.5%??梢?jiàn)2,4-D濃度對(duì)玉米幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有很大影響,而不同基因型的最大誘導(dǎo)率所需的2,4-D濃度也不相同。為防止2,4-D濃度過(guò)高影響玉米愈傷組織的分化,誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2,4-D濃度最高不超過(guò)2 mg/L。

    表2 2,4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 (%)

    2.2 影響愈傷組織繼代的因素

    2.2.1 繼代時(shí)間的影響 愈傷組織在繼代的前2~3 d,處于靜止生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)緩慢,4~5 d后愈傷組織明顯膨大,周緣開(kāi)始長(zhǎng)出米粒狀的新愈傷組織,此時(shí)生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,10~12 d以后,愈傷組織生長(zhǎng)開(kāi)始緩慢,進(jìn)入延遲生長(zhǎng)期,此時(shí)要進(jìn)行繼代培養(yǎng)。否則愈傷組織容易失去胚性,不易分化成苗。繼代時(shí)間的長(zhǎng)短是愈傷組織能否長(zhǎng)期保持胚性的關(guān)鍵因素之一,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行繼代,能夠長(zhǎng)時(shí)間保持愈傷組織的胚性。繼代時(shí)愈傷組織夾成2~3 mm的小塊轉(zhuǎn)移到新的繼代培養(yǎng)基上,夾取顏色鮮黃、較脆的胚性愈傷組織進(jìn)行繼代較好。

    2.2.2 生長(zhǎng)素濃度對(duì)繼代的影響 繼代培養(yǎng)基的2,4-D濃度一般為1 mg/L,愈傷組織生長(zhǎng)旺盛,且可以長(zhǎng)期保持胚性。2,4-D濃度過(guò)高會(huì)使愈傷組織受到傷害,同時(shí)也可以增加無(wú)性系變異2,4-D濃度過(guò)低愈傷組織生長(zhǎng)緩慢,長(zhǎng)勢(shì)不好,不利于繼代。

    2.3 影響愈傷組織再生的因素

    2.3.1 AgNO3對(duì)玉米再生率的影響 試驗(yàn)表明,在培養(yǎng)基上添加8 mg/L AgNO3可以明顯提高玉米再生率。當(dāng)AgNO3濃度高于20 mg/L時(shí),愈傷組織多數(shù)出現(xiàn)只長(zhǎng)根,不長(zhǎng)芽現(xiàn)象,或者只是產(chǎn)生一些胚狀根,雖然有綠點(diǎn),但是無(wú)法形成真正的綠苗。

    2.3.2 MET對(duì)玉米再生苗的影響 由于三角瓶中濕度大,光線(xiàn)弱,培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富,玉米再生苗在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快、莖稈細(xì)、節(jié)間長(zhǎng)、葉片發(fā)黃、植株弱小、根系不發(fā)達(dá)、移栽后不易成活。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加2 mg/L MET可以有效抑制玉米苗徒長(zhǎng),苗粗壯健康,節(jié)間縮短,葉色發(fā)綠,根系發(fā)達(dá),移栽后容易成活。

    3 結(jié)論與討論

    (1)在培養(yǎng)基的選擇上,主要采用MS和N6培養(yǎng)基,二者對(duì)于不同品種和品系玉米愈傷組織的植株再生影響不同。對(duì)于誘導(dǎo)產(chǎn)生出胚性愈傷組織,MS比N6效果好,若由幼胚直接再生植株,則N6培養(yǎng)基效果更好,MS與N6的主要區(qū)別在于氮源的形式不同。此外激素的選擇也影響愈傷組織的生成,2,4-D是影響組織脫分化的關(guān)鍵因素,較高濃度的2,4-D誘導(dǎo)外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織,降低或不加2,4-D愈傷組織才能分化出完整的胚狀體,并再生出小植株。在誘導(dǎo)愈傷組織和繼代過(guò)程中,培養(yǎng)物有三種類(lèi)型:Ⅰ型:結(jié)構(gòu)緊密,不易分開(kāi),這種愈傷組織很容易分化成芽和根或胚狀體,但不易繼代培養(yǎng)。Ⅱ型:結(jié)構(gòu)松軟,白色透明,很容易繼代培養(yǎng),但喪失了分化能力。Ⅲ型:介于Ⅰ型和Ⅱ型之間,具有明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu),白色或淺黃色,具有分化胚狀體的能力,而且又能繼代培養(yǎng)。因此,把第三種類(lèi)型篩選出來(lái),才能使繼代培養(yǎng)的愈傷組織保持它的分化能力。

    (2)根據(jù)玉米愈傷組織的類(lèi)型,可以挑選合適的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。愈傷組織分化是不整齊的,這是因?yàn)樵谟鷤M織繼代中并沒(méi)有進(jìn)行同步培養(yǎng)有關(guān)。分化率的高低與基因型和培養(yǎng)基有很大的關(guān)系,而在繼代中表現(xiàn)好的自交系其分化率也相對(duì)較高。但不同的基因型材料還應(yīng)進(jìn)一步作不同培養(yǎng)基的試驗(yàn),以提高愈傷組織的分化率。所有材料在繼代過(guò)程中都有分化現(xiàn)象出現(xiàn),有的出現(xiàn)綠點(diǎn),應(yīng)視愈傷組織生長(zhǎng)情況及時(shí)調(diào)整激素濃度及比例,如分化明顯,根毛及芽較多應(yīng)提高2,4-D濃度,降KT或BA濃度,反之則相反。但2,4-D濃度不宜超過(guò)4 mg PL,也不能在高濃度2,4-D條件下繼代時(shí)間過(guò)長(zhǎng),一旦受到此影響,材料的分化能力就很難恢復(fù)。

    (3)本實(shí)驗(yàn)所用的4個(gè)材料均能誘導(dǎo)出愈傷組織,表明玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)具有普遍性,但各個(gè)材料問(wèn)的誘導(dǎo)率差別較大,實(shí)驗(yàn)表明基因型對(duì)玉米愈傷組織的產(chǎn)生有著重要影響。Spencer等的研究發(fā)現(xiàn),玉米的基因型、幼胚大小及植株的發(fā)育狀態(tài)是影響玉米幼胚培養(yǎng)及植株再生的重要因素,其中玉米的基因型影響特別大。實(shí)驗(yàn)也表明濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效,這與王雷等在誘導(dǎo)玉米愈傷組織時(shí)的發(fā)現(xiàn)一致。中國(guó)科學(xué)院上海植生所黃璐等認(rèn)為,2,4-D雖然可以起到誘導(dǎo)的作用,但其對(duì)外植體及愈傷組織的傷害作用較大,故誘導(dǎo)時(shí)所采取的濃度不易過(guò)大,以減少組織培養(yǎng)中的無(wú)性系變異。

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