應(yīng)用多肽芯片研究非小細(xì)胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗體

李元 岳文濤 王玥 張麗娜 顧勐 許紹發(fā)

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)和最致命的惡性腫瘤之一，對(duì)人類的生命和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。研究[1]顯示臨床上無(wú)法發(fā)現(xiàn)的早期腫瘤即可以出現(xiàn)血清中自身抗體陽(yáng)性，因而血清自身抗體有望作為肺癌早期診斷的分子標(biāo)志。目前常用ELISA方法進(jìn)行血清自身抗體檢測(cè)，但是傳統(tǒng)的ELISA方法使用蛋白作為抗原，只能檢測(cè)到血清中有無(wú)自生抗體而并不能確定抗體所識(shí)別的抗原表位，因而臨床應(yīng)用意義有限，而目前抗原表為已被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)和疫苗的研發(fā)[2-4]。多肽芯片是近年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，所謂多肽芯片就是將蛋白質(zhì)分解成肽段合成到纖維素膜上組成密集的點(diǎn)陣，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，多肽芯片不僅能檢測(cè)到血清中的自身抗體，而且能夠確定自身抗體所識(shí)別的抗原表位，為進(jìn)一步研究自身抗體的功能提供線索，因此多肽芯片已被廣泛地應(yīng)用于抗體研究[5-7]。本研究利用多肽芯片檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌者血清中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的自身抗體，并確定其識(shí)別的抗原表位，為進(jìn)一步研究EGFR自身抗體與肺癌的早期診斷和預(yù)后之間的關(guān)系提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 肺癌患者血清共20例，其中腺癌和鱗癌各10例，所有肺癌患者均經(jīng)術(shù)后病理明確診斷，同時(shí)取10例健康人血清作為正常對(duì)照，所有上述血清均取自北京胸科醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本庫(kù)2008年2月-2009年2月收集的標(biāo)本。

1.1.2 試劑 Fmoc-基團(tuán)保護(hù)的20種天然氨基酸干粉（德國(guó)，Intavis公司），1-甲基-2-吡咯烷酮（1-methyl-2-pyrrolidone，NMP，Sigma公司），溴酚藍(lán)（Bromphenol blue，BPB，Sigma公司），1-羥基苯并三唑（Hydroxybenzotriazole，HOBt，上海吉爾生化），二異丙基碳二亞胺（Diisopropyl carbodiimide，DIC，Sigma公司），二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF，Sigma公司），乙酸酐（Acetic anhydride，國(guó)藥集團(tuán)），哌啶（Piperidine，國(guó)藥集團(tuán)），乙醇（Ethanol，Sigma公司），三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA，Sigma公司），三異丙基硅烷（Triisopropylsilane，Sigma公司），二氯甲烷（Dichlormethane，DCM，Sigma公司）。

1.1.3 儀器 多肽芯片合成儀ASP SL（德國(guó)，Intavis公司）

1.2 方法

1.2.1 EGFR蛋白胞外段肽庫(kù)合成 此肽庫(kù)共包括204個(gè)肽段，每個(gè)肽段的長(zhǎng)度為12個(gè)氨基酸（aa），相鄰兩個(gè)肽段之間重疊9個(gè)氨基酸，使用Fmoc-保護(hù)的20種氨基酸，按照Intavis公司ASP SL多肽芯片合成儀說(shuō)明書進(jìn)行多肽合成，將該204個(gè)肽段按6行×34列的順序合成到纖維素膜上，即構(gòu)成了多肽芯片。

1.2.2 多肽芯片質(zhì)量控制 多肽芯片合成過(guò)程中，每完成一個(gè)循環(huán)均用乙酸酐進(jìn)行Caping，封閉未反應(yīng)的NH2-基團(tuán)；同時(shí)用哌啶Deprotecting脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，使被保護(hù)的NH2-基團(tuán)暴露，以便進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)；哌啶Deprotecting之后，用染色劑溴酚藍(lán)（BPB）進(jìn)行染色，以確定未反應(yīng)的NH2-基團(tuán)已被封閉同時(shí)被保護(hù)的NH2-基團(tuán)已經(jīng)游離，以便進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。如此完成12個(gè)循環(huán)。待芯片合成結(jié)束后進(jìn)行紫外照相，進(jìn)一步觀察芯片合成質(zhì)量。

1.2.3 混合血清中EGFR自身抗體的檢測(cè) 使用EGFR多肽芯片分別檢測(cè)8例肺癌患者混合血清和10例健康對(duì)照者混合血清，以確定EGFR自身抗體在肺癌患者血清中是否存在。步驟如下：首先將膜水化（100% ETOH×10 min→75%ETOH×10 min→50% ETOH×10 min→PBS×30 min），用含有0.2% Tween-20和5%脫脂牛奶的PBST溶液室溫封閉3 h，按照1:1 000的比例稀釋混合血清與多肽芯片共同孵育，4oC孵育過(guò)夜，PBST洗膜20 min×4次，抗人HRP-標(biāo)記山羊抗人IgG（1:10 000稀釋）室溫孵育2 h，最后用PBST洗膜15 min×3次，PBS洗膜15 min×3次，ECL（普利萊公司）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)EGFR自身抗體識(shí)別的抗原表位 使用EGFR多肽芯片分別檢測(cè)20例肺癌患者血清，以確定EGFR自身抗體在多肽芯片上所識(shí)別的特異性位點(diǎn)即抗原表位。步驟同混合血清檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。高頻位點(diǎn)的確定，以頻率（F）＞2×中位數(shù)（Md）為判斷依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制 在合成過(guò)程中，每一個(gè)循環(huán)去保護(hù)后經(jīng)溴酚藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)：芯片背景無(wú)著色；芯片上的點(diǎn)著色均勻、無(wú)重疊，質(zhì)量良好。芯片合成后紫外照相，結(jié)果如圖1所示，共204各點(diǎn)，以6行×34列的方式排列，單點(diǎn)圓形無(wú)缺失，點(diǎn)和點(diǎn)之間無(wú)重疊，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 混合血清檢測(cè)結(jié)果 芯片檢測(cè)結(jié)果顯示在肺癌患者混合血清中存在EGFR自身抗體，而在健康對(duì)照者混合血清中不存在EGFR自生抗體。如圖2A所示黑色位點(diǎn)即為肺癌患者混合血清中EGFR自生抗體所識(shí)別的抗原表位即陽(yáng)性位點(diǎn)；而在健康對(duì)照者混合血清中則無(wú)陽(yáng)性位點(diǎn)存在如圖2B所示。

2.3 EGFR自身抗體識(shí)別的抗原表位 使用EGFR多肽芯片檢測(cè)20例肺癌患者血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6例陽(yáng)性，陽(yáng)性率30%，其中4例腺癌，2例鱗癌。將該6例陽(yáng)性患者血清中EGFR自身抗體所識(shí)別的抗原表位作成頻率分布圖，如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有9個(gè)高頻位點(diǎn)存在，該9個(gè)高頻位點(diǎn)的頻率（F）＞2×中位數(shù)（Md=16.66%）。其中A9、D4、D10、D13、E29的頻率為33.33%；D14、E28的頻率為50%；E9、E27的頻率為66.67%。9個(gè)高頻位點(diǎn)在EGFR蛋白胞外段的位置分布如圖4所示，高頻位點(diǎn)主要集中在EGFR蛋白胞外段的第III和第IV結(jié)構(gòu)域，此外第I結(jié)構(gòu)域也有1個(gè)高頻位點(diǎn)出現(xiàn)。位于第III結(jié)構(gòu)域的高頻位點(diǎn)為D4、D10、D13、D14、E9；位于第IV結(jié)構(gòu)域的高頻位點(diǎn)為E27、E28、E29；位于第I結(jié)構(gòu)域的高頻位點(diǎn)為A9。高頻位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的多肽序列即相應(yīng)的抗原表位見(jiàn)表1。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌患者約占肺癌患者總數(shù)的80%，絕大部分患者在就診時(shí)已處于晚期，因而發(fā)展新的非小細(xì)胞肺癌早期診斷方法便成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。研究[8]顯示臨床上無(wú)法發(fā)現(xiàn)的早期腫瘤即可以出現(xiàn)血清中自身抗體陽(yáng)性，因而血清自身抗體有望作為肺癌早期診斷的分子標(biāo)志。

圖 1 EGFR多肽芯片合成后紫外照相結(jié)果。Fig 1 UV photogram after peptide-array of EGFR synthesized.The library consists of 12 amino acids long peptides with 9 amino acids overlapping with the adjacent peptides immmobilised on a cellulose membrane. Letters on left-side hand of the array indicate rows. Numbers on the upper side of the array indicate columns.

圖 2 混合血清檢測(cè)結(jié)果。A：8例肺癌混合血清檢測(cè)結(jié)果，圖中黑色位點(diǎn)即為陽(yáng)性位點(diǎn)；B：10例健康人混合血清檢測(cè)結(jié)果，無(wú)陽(yáng)性位點(diǎn)。Fig 2 The result of mixed serums which is tested by peptide-array. A: The result of mixed serums of 8 NSCLC patients which is tested by peptidearray; B: The result of mixed serums of 10 nomral subjects which is tested by peptide array.

圖 3 陽(yáng)性位點(diǎn)頻率分布圖。將多肽芯片上的204個(gè)點(diǎn)作為橫坐標(biāo)，將這些位點(diǎn)在6例陽(yáng)性患者中出現(xiàn)的頻率作為縱坐標(biāo)。若一位點(diǎn)若在6例陽(yáng)性患者中均出現(xiàn)則頻率為100%，一位點(diǎn)若在6例陽(yáng)性患者中均不出現(xiàn)則頻率為0.00%。Fig 3 Frequency distribution of positive spots. Abscissa is the 204 sites in peptide array, Ordinate is the frequencies of the 204 sites in the 6 positive patients. One site is positive in all 6 patients, its frequency is 100%; One site is negative in all 6 patients, its frequency is 0.00%.

圖 4 高頻位點(diǎn)在EGFR胞外區(qū)位置分布圖。EGFR胞外區(qū)共包括621個(gè)氨基酸，分成I、II、III、IV 4個(gè)結(jié)構(gòu)域。 代表的頻率為33.33%， 代表的頻率為50%， 代表的頻率為66.67%。Fig 4 Distribution of high frequency spots in the extracellular domain of EGFR. The extracellular domain of EGFR consists of 621 amino acids and includes Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ structural domains. The frequency of is 33.33%,The frequency of is 50%, The frequency of is 66.67%.

表 1 EGFR自身抗體識(shí)別的高頻位點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的多肽序列Fig 1 The high frequency spots and the sequence of these spots

EGFR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮了重要作用，研究[9]表明多種人類腫瘤的發(fā)生與人體EGFR的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，Nakamura等[10]進(jìn)行了大量的回顧性分析發(fā)現(xiàn)在39%的肺腺癌和58%的肺鱗癌中存在EGFR的過(guò)度表達(dá)，過(guò)度表達(dá)的EGFR為腫瘤的生長(zhǎng)提供了生存信號(hào)使腫瘤避免凋亡。1996年，Glushkov等[11]發(fā)現(xiàn)在肺癌病人血清中存在EGFR自身抗體；隨后Bei等[12]的研究顯示不僅在肺癌病人血清中存在EGFR自身抗體，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌病人血清中也存在著EGFR自身抗體，這些研究表明EGFR自身抗體存在于多種腫瘤中。然而上述研究只是簡(jiǎn)單地檢測(cè)了EGFR自身抗體的有無(wú)，并未對(duì)EGFR自身抗體所識(shí)別的抗原表位進(jìn)行研究，因而其對(duì)基礎(chǔ)科研和臨床應(yīng)用的意義有限。

本研究使用EGFR多肽芯片對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗體進(jìn)行研究，不僅能檢測(cè) EGFR自身抗體是否存在，同時(shí)還能確定EGFR自身抗體所識(shí)別的抗原表位，為進(jìn)一步研究EGFR自身抗體的功能提供了新的依據(jù)。混合血清檢測(cè)結(jié)果顯示在肺癌患者血清中存在EGFR自身抗體，而在健康對(duì)照者血清中不存在EGFR自身抗體，這與Bei等[8]使用Western方法得到的結(jié)果相同，這說(shuō)明多肽芯片這一方法可以用于非小細(xì)胞肺癌患者血清中EGFR自身抗體的檢測(cè)，同時(shí)也提示EGFR自身抗體有望作為非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物用于肺癌的早期診斷。

EGFR多肽芯片無(wú)論是在檢測(cè)肺癌患者混合血清還是檢測(cè)肺癌患者單個(gè)血清時(shí)，均發(fā)現(xiàn)了EGFR自身抗體所識(shí)別的抗原表位，目前關(guān)于EGFR自身抗體研究的報(bào)道很少，而關(guān)于EGFR自身抗體所識(shí)別抗原表位的研究這應(yīng)該還是第一次，因而EGFR自身抗體所識(shí)別的抗原表位的發(fā)現(xiàn)將對(duì)后續(xù)的研究提供新的線索。

單個(gè)血清檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20例非小細(xì)胞肺癌患者中有6例陽(yáng)性，EGFR自身抗體在這6例陽(yáng)性患者中所識(shí)別的抗原表位不完全相同，但是也有一些抗原表位被這些陽(yáng)性患者同時(shí)識(shí)別，因而便產(chǎn)生了一些高頻位點(diǎn)。這9個(gè)高頻位點(diǎn)在6例陽(yáng)性肺癌患者中出現(xiàn)的頻率為33.33%-66.67%，高頻位點(diǎn)的存在提示在EGFR蛋白胞外區(qū)存在著一些重要的功能位點(diǎn)，阻斷這些功能位點(diǎn)就有可能影響EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能。通過(guò)做高頻位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分布圖發(fā)現(xiàn)這些高頻位點(diǎn)主要集中在EGFR蛋白胞外段的第III和第IV結(jié)構(gòu)域，此外第I結(jié)構(gòu)域也存在1個(gè)高頻位點(diǎn)。晶體結(jié)構(gòu)研究[13,14]發(fā)現(xiàn)EGFR與其配體的結(jié)合部位主要由EGFR胞外區(qū)的第I和III結(jié)構(gòu)域組成；第IV結(jié)構(gòu)域主要調(diào)節(jié)第II結(jié)構(gòu)域的功能，而第II結(jié)構(gòu)域?yàn)镋GFR胞外段的二聚化臂。高頻位點(diǎn)集中在這些結(jié)構(gòu)域，可能是通過(guò)影響這些區(qū)域的功能，而進(jìn)一步影響EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能。高頻位點(diǎn)和高頻位點(diǎn)集中分布這兩個(gè)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為我們進(jìn)一步研究EGFR和EGFR自身抗體的功能提供了新的線索。

綜上所述，本研究利用多肽芯片檢測(cè)到了肺癌患者血清中存在EGFR自身抗體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了EGFR自身抗體識(shí)別的高頻位點(diǎn)和高頻位點(diǎn)的集中分布，為進(jìn)一步研究EGFR自身抗體的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為疫苗的研發(fā)指明了方向，隨著研究的不斷深入EGFR自身抗體將對(duì)肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供更大的幫助。