豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力

石 娜 ，尹杰超 ，Dante Zarlenga ，李廣興，任曉峰*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；3.美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所中心牛功能基因組和動物寄生蟲病實驗室，馬里蘭州 20705）

PRRS病毒（PRRSV）的GP5蛋白是PRRSV的主要結構蛋白，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體和細胞免疫反應[1]。GP5有6個抗原決定簇，能誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體，是理想且常用的免疫原。

白細胞介素-15（I nterleukin-15，IL-15）是Grabstein于1994年在檢測猿腎上皮細胞培養(yǎng)上清液時首次發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子[2]。IL-15的生物學作用范圍廣泛，如促進B細胞、T細胞、NK細胞和LAK細胞的增殖分化及細胞毒活性。近來又發(fā)現(xiàn)它以自分泌的方式調(diào)節(jié)單核巨噬細胞分泌細胞因子[3]；還可刺激活化的B細胞分泌抗體。因此，IL-15極具開發(fā)新型免疫佐劑和免疫增強劑的潛力。本試驗利用分子克隆方法分別構建了表達豬IL-15和PRRSV GP5基因的重組質(zhì)粒，評價了IL-15對GP5基因免疫的增強效果，為新型疫苗的研制提供了參考數(shù)據(jù)。目前防治PRRSV的主要措施是疫苗接種，而傳統(tǒng)疫苗的存在一定的不足。核酸疫苗的出現(xiàn)為克服弱毒疫苗的易返祖、潛在感染等缺陷和傳染病的防治提供了新思路[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒，工程菌

PMD-18-T-ORF5ORF6質(zhì)粒由本實驗室構建；PUC-18-IL-15質(zhì)粒由美國農(nóng)業(yè)部Dante Zarlenga博士構建；pVAX1、感受態(tài)菌JM109、PRRSV GP5基因等均由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和試劑

脂質(zhì)體轉染試劑（L ipofectamineTMReagent）購自Invitrogen公司；血清購自上海依科賽公司；T4連接酶，各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa大連生物工程公司；飛捷RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自南京凱基公司；PE標記的抗鼠CD8+，F(xiàn)ITC標記的抗鼠CD4+抗體，HRP標記的山羊抗鼠IgG均購自歐瑞德公司。

1.1.3 實驗動物

6～8周齡昆明小鼠，體重為18～25 g·只-1，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，實驗鼠分組后按3只·組-1進行準備。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV ORF5-pVAX1載體的構建及表達

1.2.1.1 PRRSV ORF5基因的PCR擴增

按文獻[5]方法，以質(zhì)粒PMD-18-T-ORF5ORF6基因的核苷酸序列設計了1對引物，同時考慮外源基因的表達量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列（GCCACC），擴增ORF5基因的引物為：

上游引物P1：5′GGGGAAGCTTGCCACCATGT TGGAGAAA3′；

下游引物P2：5′CCCCGGATCCCTAAGGACGA CCCCATTG3′。

在上、下游引物中分別添加了HindⅢ酶切位點和Bam HⅠ酶切位點。

以質(zhì)粒PMD-18-T-ORF5ORF6為模板，擴增ORF5基因，反應體系如下：10×PCR buffer 5μL；dNTP Mixture 4μL；模板2μL；Ex Taq 0.5μL；用ddH2O補至50μL。擴增條件：預變性：95℃5 min；變性：94℃1 min；退火：41.7℃1 min；延伸：72℃1 min共30 cycles最終延伸72℃10 min。

1.2.1.2 PRRSV ORF5-p VAX1載體的構建

按文獻[6]方法，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Bam HⅠ消化PCR純化產(chǎn)物和pVAX1，分別獲得PRRSV ORF5基因片段和線性載體pVAX1，按照百泰克膠回收試劑盒說明書進行膠回收。連接、轉化、挑菌、提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Bam HⅠ鑒定。

1.2.1.3 重組質(zhì)粒的純化和轉染細胞

質(zhì)粒的小量制備及純化，貯存于-20℃。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)BHK-21細胞，待細胞長至對數(shù)生長期時質(zhì)粒轉染細胞。采用脂質(zhì)體法：將BHK-21細胞加入裝有細胞爬片的24孔板培養(yǎng)孔內(nèi)，待細胞長滿70%～80%時，采用脂質(zhì)體轉染法將PRRSV ORF5-pVAX1真核質(zhì)粒轉染細胞，同時設立空載體對照組，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 豬IL-15-pVAX1載體的構建及表達

1.2.2.1 豬IL-15基因的PCR擴增

以質(zhì)粒PUC-18-IL-15基因的核苷酸序列設計了1對引物，擴增豬IL-15基因的引物為：

上游引物P3：5′GGGGAAGCTTATGAGAATTT TGAAACCA 3′；

下游引物P4：5′CCCCCTCGAGTCAAGAAGTG TTGATGAA 3′。

在上、游引物中分別添加了HindⅢ酶切位點和Xh oⅠ酶切位點。

以質(zhì)粒PUC-18-IL-15為模板，擴增豬IL-15基因，反應體系如下：10×PCR buffer 5μL；dNTP Mixture 4μL；模板2μL；Ex Taq 0.5μL；用ddH2O補至50μL。擴增條件：預變性：95℃5 min；變性：94℃1 min；退火：48.4℃1 min；延伸：72℃1 min共30 cycles最終延伸72℃7 min。

1.2.2.2 IL-15-pVAX1載體的構建

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Xh oⅠ消化PCR純化產(chǎn)物和pVAX1，分別獲得IL-15基因片段和線性載體pVAX1，按照百泰克膠回收試劑盒說明書進行膠回收。連接、轉化、挑菌、提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Xh oⅠ鑒定后進行測序。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒的純化和轉染細胞

方法同1.2.1.3。

1.2.2.4 RT-PCR檢測豬IL-15基因的轉錄情況

如1.2.1.3提取細胞總RNA，經(jīng)反轉錄后分別用引物P3和P4擴增。

1.2.3 小鼠免疫

根據(jù)文獻[7]，用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，用適量滅菌的0.1 mol·L-1PBS將終濃度調(diào)整到1μg·μL-1。將小鼠隨機分成7組（見表1），腿部肌肉先注射鹽酸利多卡因50μL·只-1，15 min后再接種質(zhì)粒，分別按以下分組和不同劑量免疫小鼠。每間隔兩周免疫1次，分別于免疫后3 h，7、14、21、28、35及42 d，眼球取血制備血清檢測抗體，并檢測T淋巴細胞亞群的數(shù)量。

表1 核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫小鼠分組及免疫程序Table 1 Grouping and immunization of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

1.2.4 外周血淋巴細胞的分離培養(yǎng)

小鼠眼球采血，加3.8%檸檬酸鈉抗凝劑制備抗凝血，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，2 000 r·min-1離心20 min。收集淋巴細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗2次。細胞沉淀用1 mL RPMI 1640營養(yǎng)液懸浮，用臺盼藍染色法檢測細胞活力＞95%，調(diào)整至1×107個細胞·mL-1。

1.2.5 外周血淋巴細胞亞群數(shù)量的檢測

按1.2.4制備外周血淋巴細胞懸液，每份樣品各取500μL，3 000 r·min-1離心5 min沉淀淋巴細胞。用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次，每次3 000 r·min-1離心5 min。然后分別加入1：1 000稀釋的CD4+-FITC標記、CD8+-PE標記抗體的預冷PBS 100 μL進行反應，4℃孵育30 min后，用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次，加入500μL緩沖液重懸，流式細胞儀檢測。

1.2.6 ELISA檢測抗體

①將PRRSV ORF5蛋白純化后用0.05 mol·L-1NaHCO3稀釋成50μg·μL-1，加入酶標板中，100 μg·孔-1，4℃靜置包被過夜；②用PBST洗板3次，加入200μg·孔-1的封閉液，37℃作用2 h；③PBST洗板3次，加入50倍稀釋的被檢血清樣品，100μg·孔-1，37℃作用1 h；陰性對照孔用未免疫小鼠血清；④PBST洗板3次，加入5 000倍稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG酶標抗體100μg·孔-1，37℃作用1 h；⑤加入新配制的顯色液OPD 100 μg·孔-1，37℃閉光作用10 min，加2 mol·L-1硫酸50μL終止反應，在酶聯(lián)免疫檢測儀上依次讀取490 nm下的OD值。

1.2.7 IFN-γ的檢測摘除眼球取血，收集血清，雙抗夾心ELISA法測定IFN-γ，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。所有資料均用（X±S）表示，采用多樣本均數(shù)比較的方差分析法。

2 結果與分析

2.1 真核重組質(zhì)粒構建

利用分子克隆技術將PRRSV ORF5和豬I L-15基因分別插入到真核表達載體pVAX1的多克隆位點上，經(jīng)酶切初步鑒定后進行測序。測序結果表明重組質(zhì)粒中外源基因序列沒有基因突變、插入及缺失，證明在克隆重組過程中，沒有導致目的基因改變。

2.2 重組質(zhì)粒轉染BHK-21細胞后RT-PCR結果

為證實構建表達質(zhì)粒的表達效果，將表達質(zhì)粒轉染BHK-21細胞后，用試劑盒提取RNA，并進行RT-PCR。如圖1所示，轉染重組質(zhì)粒后，插入的目的基因均可通過RT-PCR方法檢測到，表明重組質(zhì)粒能夠在真核細胞內(nèi)進行復制，說明構建的二個重組質(zhì)粒能在真核哺乳動物細胞中表達，為開展體內(nèi)試驗研究提供依據(jù)。

圖1 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1重組質(zhì)粒轉染后RT-PCR結果Fig.1 RT-PCR product of the recombinate plasmids PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1 transfected to BHK-21 cell

2.3 核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫對外周血CD4+細胞數(shù)量的影響

核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1通過肌肉注射免疫小鼠后，用流式細胞儀對小鼠外周血CD4+細胞含量進行檢測，結果表明，實驗組CD4+細胞數(shù)量明顯高于PBS對照組和pVAX1對照組，差異極顯著（P＜0.01），表明加佐劑與不加佐劑肌肉注射免疫都誘導CD4+細胞免疫應答，而且加佐劑組明顯高于不加佐劑組，但差異不顯著（P＞0.05）。見圖2。該結果提示PRRSV ORF5有可能能通過細胞免疫途徑增強機體的免疫能力，同時分子佐劑豬IL-15能有效增強該基因疫苗的免疫效果。

2.4 核酸疫苗PRRSV ORF5-p VAX1和豬IL-15-pVAX1免疫后對小鼠外周血CD8+細胞數(shù)量的影響

核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫后，用流式細胞儀檢測小鼠外周血CD細胞數(shù)量。結果表明，加佐劑組外周血CD細胞數(shù)量明顯高于PBS對照組和pVAX1對照組，差異極顯著（P＜0.01），佐劑組明顯高于不加佐劑組，差異極顯著（P＜0.01）。如圖3。該結果提示本試驗構建的基因疫苗在提高細胞免疫的同時有可能增強抗體生成。也表明IL-15可有效提高T淋巴細胞的功能。

圖2 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1核酸疫苗免疫后小鼠外周血CD4+細胞數(shù)量的變化Fig.2 Changes of CD4+in peripheral lymphocytes of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

圖3 PRRSV ORF5-p VAX1和豬IL-15-p VAX1核酸疫苗免疫后小鼠外周血CD8+細胞數(shù)量的變化Fig.3 Changes of CD8+in peripheral lymphocytes of mice inoculated with PRRSV ORF5-p VAX1 and pig IL-15-pVAX1

2.5 ELISA抗體檢測

ELISA抗體檢測結果見圖4。所構建的核酸疫苗均能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，且加佐劑組抗體水平明顯高于PBS對照組（P＜0.05），差異顯著，加佐劑組要高于pVAX1對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；同時還發(fā)現(xiàn)，加佐劑組高于PRRSV ORF5-pVAX1單獨注射組，但是差異不顯著（P＞0.05）。該試驗結果表明PRRSV ORF5基因疫苗能提高體液免疫水平。然而，佐劑分子豬IL-15不能有效地直接提高該疫苗的抗體生成水平。

圖4 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1核酸疫苗免疫后抗PRRSV IgG的動態(tài)變化Fig.4 Antibody changes of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

2.6 小鼠IFN-γ的檢測結果

采用雙抗夾心ELISA法檢測小鼠血清中的IFN-γ，檢測結果見表2。

表2 小鼠血液中IFN-γ的水平(-±S)Table 2 L evel of IFN-γin blood of mice(-±S)

表2 小鼠血液中IFN-γ的水平(-±S)Table 2 L evel of IFN-γin blood of mice(-±S)

注：A-PRRSV ORF5-pVAX1；B-豬IL-15-pVAX1組；C-PR RSV ORF5-pVAX1與豬IL-15-pVAX組；D-pVAX1組；E-PBS組Note:A-PRRSV ORF5-pVAX1;B-Porcine IL-15-pVAX1;C-PR RSV ORF5-pVAX1 and porcine IL-15-pVAX;D-pVAX1;E-PBS

佐劑組小鼠IFN-γ水平明顯高于PBS組和空載體組，差異有顯著性（P＜0.05）。該試驗結果進一步證實了豬IL-15可有效提高PRRSV ORF5基因疫苗的免疫效果，但以提高細胞免疫水平為主，而該分子沒有明顯提高疫苗激發(fā)的體液免疫應答能力。

3 討 論

IL-15具有與IL-2相似的生物學功能，但其不良反應弱于IL-2。將編碼IL-15的真核表達載體與PRRSV ORF5-pVAX1疫苗共同免疫小鼠。結果表明，IL-15真核表達載體可在增強宿主特異性細胞免疫功能方面有協(xié)同作用。聯(lián)合注射IL-15-pVAX1與PRRSV ORF5-pVAX1真核表達質(zhì)粒組抗PRRSV產(chǎn)生能力雖高于單純注射PRRSV ORF5-pVAX1疫苗組，但兩組相比差異無顯著性。說明IL-15在提高體液免疫反應方面無明顯增強作用。分析其原因可能是由于IL-15屬于Th1類細胞因子，可能在誘導細胞因子表達增加的同時，通過免疫網(wǎng)絡抑制了Th2細胞的活性，因此降低了其體液免疫水平。

研究認為，IFN-γ的水平可以反映細胞介導的免疫反應的強度[8]。在本試驗中，接種了PRRSV ORF5-pVAX1疫苗的小鼠血清中，可以檢測到IFN-γ，而PBS及空載體對照組則檢測到很少量。說明本試驗所采用的PRRSV ORF5-pVAX1基因疫苗具有免疫原性，能夠誘導細胞免疫應答，與國內(nèi)外其他報道一致[9-10]。核酸疫苗既有亞單位疫苗的安全性，又有弱毒疫苗的有效性，能同時誘導機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應答，是一種有前景的疫苗[11]。而PRRSV ORF5-pVAX1與豬IL-15-pVAX1共同注射可提高血清中IFN-γ的水平，進一步證實豬IL-15是一個有效的分子佐劑。

4 結論

本試驗成功地構建了表達PRRS病毒GP5和豬IL-15的核酸疫苗。通過體外實驗證明該兩種質(zhì)?？稍谡婧思毎械膹椭?。動物實驗表明PRRSV GP5基因疫苗可有效誘導機體的細胞與體液免疫應答水平。豬IL-15可作為分子佐劑提高GP5基因疫苗的免疫效果，并以提高其細胞免疫能力為主要效應。本試驗結果及其評價研究為研制PRRS新型疫苗提供了參考數(shù)據(jù)。

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