超聲波對(duì)麥胚蛋白性質(zhì)及其酶解物ACE抑制活性的影響

趙偉睿, 馬海樂(lè)＊,2,3, 賈俊強(qiáng), 李云亮, 楊會(huì)麗

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471039;3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

超聲波對(duì)麥胚蛋白性質(zhì)及其酶解物ACE抑制活性的影響

趙偉睿1, 馬海樂(lè)＊1,2,3, 賈俊強(qiáng)1, 李云亮1, 楊會(huì)麗1

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471039;3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

為了提高麥胚分離蛋白酶解產(chǎn)物的降血壓活性,采用超聲波處理麥胚分離蛋白。研究了超聲波功率對(duì)麥胚分離蛋白的溶解度、表面疏水性、熒光光譜、巰基含量變化、水解度和酶解產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)相對(duì)抑制活性的影響。結(jié)果表明:經(jīng)超聲波處理后,小麥胚芽球蛋白的熒光光譜和巰基含量均發(fā)生了顯著的變化。麥胚分離蛋白的溶解度和表面疏水殘基含量隨著超聲波功率的增加而提高,但當(dāng)超聲功率達(dá)到800 W后,增幅趨于平緩。經(jīng)超聲波前處理后,ACE抑制活性明顯提高,而麥胚分離蛋白的酶解產(chǎn)物水解度沒(méi)有明顯變化,因此ACE抑制活性的提高是由于蛋白結(jié)構(gòu)的變化造成的。在超聲功率800 W時(shí),酶解產(chǎn)物的ACE相對(duì)抑制活性提高了41.09%。

超聲波處理;麥胚蛋白;結(jié)構(gòu);ACE抑制活性;酶解

在食品的加工與消化過(guò)程中,蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白酶的作用會(huì)釋放出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽,它通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性,阻礙有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ的生成,同時(shí)抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解,從而起到降血壓作用[1]。由于食物源ACE抑制肽因其安全性高,副作用小,易吸收等特點(diǎn),使酶解蛋白質(zhì)制備ACE抑制肽成為了生物活性肽研究的熱點(diǎn)[2-3]。

通過(guò)物理場(chǎng)作用可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而改變蛋白質(zhì)的加工性能,降解性能以及暴露[4]。超聲波作為一種物理強(qiáng)化手段,可在瞬間產(chǎn)生高溫和幾千個(gè)大氣壓的高壓,并伴有強(qiáng)大的沖擊波或射流[7]。因此,超聲波會(huì)使媒質(zhì)的狀態(tài)、組成、結(jié)構(gòu)和功能等發(fā)生變化。本研究通過(guò)超聲前處理麥胚分離蛋白,在研究超聲波處理對(duì)小麥胚芽分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響的基礎(chǔ)上,研究了超聲波前處理麥胚蛋白對(duì)制備麥胚蛋白降血壓肽活性的影響,為超聲波強(qiáng)化制備小麥胚芽分離蛋白降血壓肽提供了一定的理論和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂小麥胚芽:河南漫天雪面粉廠(chǎng)產(chǎn)品;中溫淀粉酶480L(527.50KNU/g):Novo公司;Alcalase2.4LFG蛋白酶(2.670AU/g):Novo公司產(chǎn)品;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、1–苯胺基–8–萘磺酸鹽(ANS)、5,5’–二硫代–2–硝基苯甲酸(DTNB),Sigma公司產(chǎn)品;N-(3[2-Furyl]Acryloyl)-Phe-Gly-Gly(FAPGG),Fluka公司產(chǎn)品;其余試劑均屬?lài)?guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

WFJ 7200型可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市富華儀器有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀:Thermo公司生產(chǎn)。GA99-ⅡD超聲細(xì)胞粉碎機(jī):(該設(shè)備超聲的頻率為20kHz),無(wú)錫上佳生物科技公司產(chǎn)品; Avanti J–25高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman公司生產(chǎn);Cary Eclipse熒光分光光度計(jì):美國(guó)Varian公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 麥胚分離蛋白的提取 采用文獻(xiàn)[8]的a-淀粉酶法提取麥胚分離蛋白(DWGP),略有改動(dòng)。將脫脂后小麥胚芽用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩,將脫脂小麥胚芽粉按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%加入蒸餾水中,按1 g/dL加入NaCl,攪拌30 min,用1mol/L的NaOH溶液調(diào)制p H值9.0下攪拌30 min,5 000 r/ min離心20 min,獲得上清液用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)p H值到6.5,采用中溫淀粉酶在70℃下酶解180 min,加酶量為3 g/dL;酶法降解淀粉后,調(diào)節(jié)p H到4,得到沉淀,用水溶解,調(diào)節(jié)p H值至7.0,噴霧干燥。

1.3.2 麥胚分離蛋白的超聲處理 配置1 g/dL的麥胚蛋白溶液,并控制樣品溶液初始溫度在15℃。分別用80 mL的麥胚蛋白溶液在不同超聲功率處理20 min。對(duì)處理后的樣品分別進(jìn)行理化性質(zhì)和功能性質(zhì)分析。

1.3.3 麥胚分離蛋白的酶解 將處理與未處理的麥胚蛋白溶液在50℃水浴中平衡至50℃,加入20 μL Alcalase2.4LFG蛋白酶,在p H為9.0的條件下酶解60 min,在沸水域中滅酶10 min,冷卻到室溫。12 000 r/min離心10 min,移取全部上清,定溶至100 mL。

1.3.4 肽液濃度的測(cè)定方法 肽液濃度測(cè)定采用福林酚法[9]。

1.3.5 麥胚分離蛋白溶解度的測(cè)定 溶解性是蛋白質(zhì)的最基本的物理性質(zhì),是影響蛋白質(zhì)深度加工與應(yīng)用的重要指標(biāo)。將超聲處理前后的麥胚分離蛋白溶液在轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心10 min,用Folin–酚法測(cè)定上清液中蛋白含量[10],以可溶性蛋白含量表示溶解度的變化。

1.3.6 麥胚分離蛋白的表面疏水性的測(cè)定 表面疏水性采用Kato and Nakai的ANS熒光測(cè)定法[11],熒光強(qiáng)度與蛋白的表面疏水殘基含量成正相關(guān)。測(cè)定方法:將超聲波處理與未處理的蛋白樣品用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉–磷酸二氫鈉(p H7.0)緩沖液稀釋到0.50 mg/mL,取稀釋樣品4 mL,加入20μL 1–苯胺基–8–萘磺酸鹽(ANS)溶液(0.01 mol/L),在激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm(狹縫寬度為5nm),發(fā)射波長(zhǎng)為400～650nm(狹縫寬度為10 nm)測(cè)其熒光值,掃描速度為5nm/s。

1.3.7 熒光光譜掃描 將超聲波處理與未處理的蛋白樣品用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉–磷酸二氫鈉(p H7.0)緩沖液稀釋到0.50 mg/mL分別用熒光分光光度計(jì)掃描,掃描條件為激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)400～800 nm,激發(fā)縫寬為2.5 nm,發(fā)射縫寬為5 nm。同時(shí)用未經(jīng)超聲波處理的蛋白樣品作對(duì)照。

1.3.8 麥胚分離蛋白游離巰基含量的測(cè)定 游離巰基(SHF)含量采用Beveridge,Toma,and Nakai (1974).的測(cè)定方法[12],略有改動(dòng):取1 g/dL的麥胚蛋白溶液樣品2 mL,加入到6 mL含有8 mol/L尿素的p H 8.0的Tris–Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L glycine、0.004 mol/L EDTA)中,攪拌溶解1h,10 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液加入80μL Ellman’s試劑,立即混勻,5 min后測(cè)定412 nm吸光度。以不加樣品,而加Ellman’s試劑為空白。

以Ellman’s試劑–SH的摩爾吸光系數(shù)為1.36×104計(jì)算游離巰基(SHF)的含量,SHF的計(jì)算公式如下:

式中 A412為412nm吸光度;c為樣品蛋白質(zhì)(mg/ mL).D為稀釋倍數(shù)。

1.3.9 水解度(DH)測(cè)定方法 水解度定義為產(chǎn)物中非蛋白氮含量與反應(yīng)底物蛋白質(zhì)質(zhì)量的比值[13]。非蛋白氮是通過(guò)在反應(yīng)樣品中加入6 g/dL的三氯乙酸,震蕩5min,12 000 r/min離心10min制備,用福林酚法測(cè)定其濃度。底物蛋白質(zhì)含量由微量凱式定氮法測(cè)定。

1.3.10 ACE抑制活性的測(cè)定 采用FAPGG作為ACE的底物[14-15],按表1添加各反應(yīng)組分,用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的ACE抑制活性。測(cè)定波長(zhǎng)為340 nm。設(shè)空白孔的初始吸光度為a1,樣品孔的初始吸光度為b2,在37℃的環(huán)境中反應(yīng)30 min后再次測(cè)定在340 nm的吸光度,反應(yīng)后空白孔的吸光度為a2,樣品孔的吸光度為b2,空白的吸光度減少值A(chǔ)=a1-a2,樣品的吸光度減少B=b1-b2,抑制率I=(A-B)/A。樣品相應(yīng)抑制率的質(zhì)量濃度為c(mg/ mL),樣品的相對(duì)抑制活性為W=I/C,單位為mL/mg。

表1 ACE抑制活性的測(cè)定Tab.1 Determination of the ACE inhibition activity

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理對(duì)麥胚分離蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)物化性質(zhì)的指標(biāo)之一,并且和蛋白質(zhì)的起泡性,凝膠性和乳化性相關(guān)[16]。不同超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白溶解度的變化如圖1所示。

圖1 不同超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound power on the isolated soy protein solubility

由圖1結(jié)果表明,超聲處理可顯著提高蛋白質(zhì)的溶解度。當(dāng)超聲波功率低于800 W時(shí),隨著超聲波功率的增加,小麥胚芽蛋白的溶解度迅速增加;超聲波功率大于800 W時(shí),小麥胚芽蛋白的溶解度增幅變緩。分析原因可能是:首先超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)打開(kāi)蛋白聚集體同時(shí)打斷了蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu),釋放出小分子的亞基,蛋白分子部分展開(kāi),形成溶于水的非共價(jià)鍵分子,與溶劑水的相互作用力加強(qiáng),使其溶解度增加[17],說(shuō)明麥胚分離蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在經(jīng)超聲處理后放生了改變。但隨著超聲處理功率增大,在考察范圍內(nèi)的超聲波能量不能進(jìn)一步將分子進(jìn)一步打斷,所以溶解度變化不大[18]。

2.2 超聲處理對(duì)麥胚分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性(H0)是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和相關(guān)功能性質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)參數(shù),超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白H0(以熒光強(qiáng)度表征)的影響如圖2所示,H0開(kāi)始隨著超聲功率的增大而增大,當(dāng)超聲功率超過(guò)800 W時(shí)H0就不在增大,幾乎保持不變,在800 W時(shí)H0比未超聲提高了22.39%。這與溶解度的變化趨勢(shì)是一直的。說(shuō)明超聲處理可以使麥胚分離蛋白分子展開(kāi),破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用,使蛋白分子內(nèi)部的疏水殘基和集團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子表面,從而使H0提高。同樣當(dāng)處理功率達(dá)到一定程度后,在考察范圍內(nèi)的超聲波所具有的能量不能進(jìn)一步將分子打斷[18],所以不能使H0進(jìn)一步提高。

圖2 超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白ANS熒光光譜的影響Fig.2 Effect of ultrasound power on the isolated DWPGANS fluorescence intensity

隨著超聲波功率的增加,麥胚分離蛋白表面疏水性開(kāi)始增加,蛋白的溶解度也持續(xù)平穩(wěn)增加, Yingqiu Li等在研究脈沖電場(chǎng)對(duì)大豆分離蛋白物理化學(xué)性質(zhì)的影響時(shí)也出現(xiàn)了這種現(xiàn)象[10]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能歸因于以下兩個(gè)方面:①蛋白質(zhì)中的自由氨基群能和鄰近羧基群發(fā)生靜電引力,使蛋白分子聚集,溶解度下降;超聲波處理能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的聯(lián)系,阻止蛋白分子聚集,使蛋白溶解度得到提高[19]。②小麥胚芽蛋白中谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸含量較高,當(dāng)小麥胚芽球蛋白經(jīng)超聲波處理后,其分子發(fā)生了伸展,使較多的谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸充分暴露,這些氨基酸的暴露對(duì)蛋白溶解度的提高具有重要作用[20]。

2.3 超聲波處理對(duì)小麥胚芽分離蛋白熒光光譜的影響

圖3 超聲波功率對(duì)小麥胚芽球蛋白熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the fluorescence spectra of wheat germ globulin

分別對(duì)不同超聲波功率處理的小麥胚芽球蛋白進(jìn)行熒光掃描,掃描條件為激發(fā)波長(zhǎng)380 nm,發(fā)射波長(zhǎng)300～700 nm。熒光光譜截圖如圖3所示。從圖3可以看出,在超聲波前處理麥胚芽分離蛋白的激發(fā)熒光強(qiáng)度在發(fā)射波長(zhǎng)340 nm附近明顯高于對(duì)照組,且熒光峰移動(dòng)了10 nm;而不同超聲處理下蛋白激發(fā)熒光強(qiáng)度和熒光峰位置差異不大。蛋白具有內(nèi)源熒光,蛋白激發(fā)熒光強(qiáng)度的改變或者發(fā)射波長(zhǎng)的改變都可以說(shuō)明蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[21]。

2.4 超聲處理對(duì)麥胚蛋白游離巰基含量的影響

圖4 不同超聲處理功率對(duì)麥胚分離蛋白SHF含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment power on the SHF content of the isolated DWPG

不同超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白巰基含量SHF的影響如圖4所示,從圖4可以看出,在超聲波功率低于400 W時(shí),隨著超聲波功率的增加,小麥胚芽球蛋白巰基含量迅速增加,在超聲波功率低于400 W時(shí)超聲處理的麥胚分離蛋白的游離巰基含量增加幅度較小。蛋白分子中巰基的減少意味著蛋白分子的折疊,相反則說(shuō)明蛋白分子發(fā)生了伸展[10,22]。本研究中,巰基的變化說(shuō)明小麥胚芽分離蛋白經(jīng)超聲波處理后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,蛋白分子發(fā)生了伸展。

2.5 超聲處理對(duì)麥胚水解度的影響

不同超聲功率前處理對(duì)Alcalase酶解相應(yīng)處理小麥胚芽分離蛋白樣品水解度的影響如圖5所示。從圖5中可以看出超聲處理并沒(méi)有對(duì)水解度產(chǎn)生影響,因此超聲處理沒(méi)有促使更多的肽鍵被水解。

2.6 超聲處理對(duì)酶解制備麥胚分離蛋白ACE抑制肽活性的影響

不同超聲功率下前處理對(duì)制備小麥胚芽分離蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響如表2所示。由結(jié)果表明,超聲波前處理可以有效提高ACE的相對(duì)抑制活性,ACE相對(duì)抑制活性在800W處理后就幾乎不在增加。這與超聲處理對(duì)麥胚分離蛋白表面疏水性影響的變化規(guī)律是一致的。因此在測(cè)定條件下采用800W,前處理20min麥胚分離蛋白就可以有效提高酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性,使相對(duì)抑制活性提高41.09%。

圖5 不同超聲功率對(duì)麥胚分離蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on the hydrolysis degree of the isolated DWPG

由于Alcalase酶解超聲處理麥胚分離蛋白時(shí)與未處理之間的水解度沒(méi)有變化,可以推斷出相對(duì)ACE抑制活性的提高不是由于水解產(chǎn)生了更多肽造成的。而超聲波處理對(duì)麥胚分離蛋白表面疏水集團(tuán)的含量,溶解度和游離巰基含量的影響可以看出,當(dāng)超聲波功率低于800 W時(shí),隨著超聲波功率的增加,麥胚芽分離蛋白的結(jié)構(gòu)變化迅速;超聲波功率大于800 W時(shí),麥胚分離蛋白的結(jié)構(gòu)變幅變緩。而相應(yīng)超聲處理的麥胚分離蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)ACE抑制率變化與結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)基本相同。因此,超聲前處理麥胚分離蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制活性提高是由于超聲處理使麥胚蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化暴露了新的酶切位點(diǎn)。具體表現(xiàn)為麥胚蛋白表面疏水性著顯提高,疏水殘基和集團(tuán)外露,而肽段C端為疏水性氨基酸是高活性ACE抑制肽的重要條件,Alcalase可作用的疏水性位點(diǎn)增多,促進(jìn)了末端疏水性多肽的釋放,產(chǎn)生了相對(duì)較多的高活性的ACE抑制肽。

表2 超聲波功率對(duì)制備小麥胚芽分離蛋白ACE抑制肽活性的影響Tab.2 Effect of ultrasound power on the ACE inhibitory activity of DWGP hydrolysis protein

4 結(jié) 語(yǔ)

1)超聲波處理麥胚蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)分析表明:超聲波處理可以提高麥胚分離蛋白的表面疏水性和麥胚分離蛋白的溶解度,游離巰基含量以及超聲波處理后麥胚分離蛋白的熒光光譜發(fā)生變化,說(shuō)明超聲處理前后麥胚分離蛋白處理前后結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2)超聲波前處理麥胚分離蛋白可以提高制備的麥胚分離蛋白ACE抑制肽的抑制活性;在測(cè)定條件下采用800W,前處理20min麥胚分離蛋白就可以有效提高酶解產(chǎn)物的ACE相對(duì)抑制活性,達(dá)41.09%。這是由于超聲處理顯著提高了麥胚分離蛋白表面的疏水活性,疏水殘基和集團(tuán)外露(C端疏水性氨基酸是高活性ACE抑制肽的重要條件), Alcalase能作用的疏水性位點(diǎn)增多,促進(jìn)了末端疏水性氨基酸的釋放,產(chǎn)生了相對(duì)較多的高活性的ACE抑制肽導(dǎo)致的。

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(責(zé)任編輯:楊萌)

Effect of Ultrasound Treatment on the Defatted Wheat Germ Protein Properties and its ACE Inhibition Activity

ZHAO Weirui1,MA Haile＊1,2,3, J IA Junqiang1, LI Yunliang1, Yang Huili1
(1.College of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,212013,China;2.College of Food and Biological Engineering,University of Science and Technology,Luoyang 471039,China;3.Jiangsu Provincial Research Center of Bio-processing and Separation Engineering of Agri-products,Zhenjiang 212013,China)

The aim of this study is to enhance the anti-hypertension activity of defatted wheat germ protein(DWGP)hydrolysate,for this,ultrasound was employed.The effects of ultrasonic power on the different indexes have been carefully investigated and an obvious difference on free sulfhydryl and fluorescence spectra of DWGP after ultrasound treatment was observed but the DWPG hydrolysis degree did not affectby the ultrasound treatment.The solubility and hydrophobicity of wheat germ globulin increase with the increasing of ultrasonic power(less than 800w).Furthermore,the relative ACE inhibitory activity of the hydrolysate was increased by 41.09%when treated by 800w ultrasound,due to the structure change of DWPG.

ultrasound treatment,defatted wheat germ protein isolate,structure,ACE inhibitoryactivity,enzymolysis

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

1673-1689(2010)02-0177-06

2009-04-11

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z321);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助(CX07B-183z)。

＊通信作者:馬海樂(lè)(1963-),男,陜西咸陽(yáng)人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品生物技術(shù)以及生物能源方面的研究。Email:mhl@ujs.edu.cn