用rpsL基因突變實(shí)驗(yàn)評價(jià)丙烯酰胺致突變性的方法初探

劉清岱, 王志偉, 安紅杰, 張治洲

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

用rpsL基因突變實(shí)驗(yàn)評價(jià)丙烯酰胺致突變性的方法初探

劉清岱, 王志偉, 安紅杰, 張治洲

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

采用rpsL基因突變實(shí)驗(yàn)對丙烯酰胺的致突變性進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)0.05、0.10、0. 25、0.50、1.00 mg/mL 5個(gè)丙烯酰胺的劑量組和陰性、陽性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺劑量組的突變頻率與陰性對照組相比均有顯著差異,并且有劑量效應(yīng)關(guān)系,表明丙烯酰胺可誘發(fā)rpsL位點(diǎn)的突變。由于rpsL突變實(shí)驗(yàn)自發(fā)突變背景水平低、靈敏度高,因此rpsL突變實(shí)驗(yàn)有望成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中致癌物快速檢測的有效工具。

rpsL基因突變;丙烯酰胺;致突變性

丙烯酰胺(acrylamide)作為工業(yè)加工合成聚丙烯酰胺的主要材料,廣泛應(yīng)用于人類生產(chǎn)、生活和科研等領(lǐng)域。大量研究表明,丙烯酰胺不僅具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性,而且也具有一定的致突變作用[1]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)對其致癌性進(jìn)行了評價(jià),將丙烯酰胺列為二類致癌物[2]。近年來,瑞典和德國學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些富含淀粉的食品在經(jīng)過高溫加工處理后可檢測出丙烯酰胺,使得食品中丙烯酰胺的污染問題引起了國際社會和各國政府的高度關(guān)注[3-4]。然而,目前很少有文章從分子生物學(xué)角度對丙烯酰胺的致突變原理進(jìn)行研究,因此有必要利用基因突變實(shí)驗(yàn)研究丙烯酰胺的致突變性。

作者以質(zhì)粒pMOL21的rpsL基因作為選擇標(biāo)記進(jìn)行致突變性的檢測。由rpsL基因編碼的核糖體蛋白S12可以與鏈霉素(Sm,streptomycin)形成復(fù)合物,并增強(qiáng)鏈霉素與細(xì)菌16S rRNA結(jié)合的能力,從而阻止了轉(zhuǎn)錄的起始,這就是鏈霉素藥理作用的基礎(chǔ)。若rpsL基因發(fā)生突變,將破壞16S rRNA與鏈霉素的相互作用,而導(dǎo)致細(xì)胞對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性[5]。作者采用的宿主菌MF101的rpsL基因是突變的,具有鏈霉素抗性;而質(zhì)粒pMOL21包含氨芐青霉素抗性和正確的rpsL基因序列。當(dāng)pMOL21轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后,只有質(zhì)粒的rpsL基因被誘發(fā)突變才會導(dǎo)致宿主細(xì)胞具備鏈霉素抗性(鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型),從而達(dá)到正向篩選突變r(jià)psL基因的目的[6]。本研究的實(shí)驗(yàn)方法是一種靈敏度高且簡便易行的體外短期致突變實(shí)驗(yàn)方法,為檢測食品加工過程中產(chǎn)生的潛在致癌物提供了一種快速有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒DNA

大腸桿菌MF101:具有鏈霉素抗性,可進(jìn)行rpsL突變型質(zhì)粒的篩選;質(zhì)粒pMOL21(4.1 kb),包含氨芐青霉素抗性和rpsL基因序列。菌株和質(zhì)粒均由日本奈良科技大學(xué)Hisaji Maki教授贈予。

1.2 主要試劑

氨芐青霉素(Ap,ampicillin),鏈霉素(Sm, streptomycin),丙烯酰胺(acrylamide),溴化乙錠(EB)等:均購自上海生工生物工程技術(shù)公司。

1.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞[7],將質(zhì)粒pMOL21轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MF101,涂布在含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化菌。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)和丙烯酰胺質(zhì)量濃度的確定

將帶有質(zhì)粒pMOL21的大腸桿菌MF101培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600為0.6左右),以1∶100的比例稀釋至含有丙烯酰胺的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng),并且以600 nm處的光吸收值測定大腸桿菌的生長曲線。

丙烯酰胺設(shè)0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL共5個(gè)劑量組;以溴化乙錠(EB)作陽性對照,終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL;以無菌的去離子水作為陰性對照。各組均培養(yǎng)10 h后用于rpsL突變頻率的測定。

1.5 rpsL基因突變頻率的測定

將細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板(50 μg/mL)上來確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù);涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素(50μg/mL)平板上以確定rpsL基因突變的總數(shù)。突變率是突變菌數(shù)(含Ap和Sm平板的菌數(shù))/總菌數(shù)(含Ap平板的菌數(shù))。每組至少3次重復(fù),總菌落數(shù)不低于106個(gè),用SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯酰胺對大腸桿菌生長的影響

研究了不同濃度的丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21生長在不同時(shí)間的影響,所得結(jié)果見圖1。從圖1可看出,對照組的大腸桿菌細(xì)胞振蕩培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間約為7 h。隨著丙烯酰胺劑量的增加,達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間有所延長,當(dāng)丙烯酰胺質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí),大腸桿菌細(xì)胞振蕩培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期滯后到10 h左右。細(xì)胞對數(shù)生長期的延長,表明了一定質(zhì)量濃度的丙烯酰胺抑制了大腸桿菌細(xì)胞的生長,對于大腸桿菌具有明顯的細(xì)胞毒性。

圖1 丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21生長的影響Fig.1 Effects of acrylamid onE.coliMF101/pMOL21 growth

2.2 丙烯酰胺誘發(fā)的rpsL位點(diǎn)的突變頻率(Mutation Frequency,MF)

研究了不同質(zhì)量濃度的丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21的rpsL位點(diǎn)的誘導(dǎo)突變頻率,所得結(jié)果見表1。在以水作為陰性對照測定的rpsL基因的自發(fā)突變率為1.85×10-6,這與日本奈良科技大學(xué)Hisaji Maki報(bào)道基本是一致的[8]。作者選擇分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見的誘變劑EB作為陽性對照,在較低質(zhì)量濃度下(0.01 mg/mL)即顯示出強(qiáng)的致突變性,陽性對照組突變頻率是陰性對照的6倍以上。

表1 丙烯酰胺誘發(fā)的rpsL基因突變頻率Tab.1 TherpsLgene mutation frequencies induced by acrylamide

從表1中可以看出,不同質(zhì)量濃度的丙烯酰胺下的突變頻率具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。為此,作者將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析,所得結(jié)果見圖2。

圖2 rpsL基因突變頻率與丙烯酰胺濃度的關(guān)系示意圖Fig.2 Effects of acrylamide on therpsLgene mutation frequencies

從圖2可以看出,丙烯酰胺的不同劑量組與對照組相比均有顯著性差異,并且有劑量反應(yīng)關(guān)系。各質(zhì)量濃度的丙烯酰胺與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05),該檢驗(yàn)線性顯著(R2=0.945,F= 87.26)。

3 結(jié) 語

本研究中陽性對照組rpsL基因的突變頻率是陰性對照的6倍以上,根據(jù)rpsL基因突變實(shí)驗(yàn)成立的條件判斷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。隨著丙烯酰胺作用劑量的增加,rpsL位點(diǎn)的突變頻率顯著增加,并且有劑量效應(yīng)關(guān)系,表明丙烯酰胺可以誘發(fā)rpsL位點(diǎn)的突變。值得關(guān)注的是,質(zhì)量濃度為0.05 mg/ mL的丙烯酰胺組和對照相比也呈現(xiàn)了顯著的差異,說明了該系統(tǒng)具有高度的靈敏性。

目前rpsL基因正向選擇系統(tǒng)主要應(yīng)用于DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物突變率的檢測[9]。國內(nèi)有關(guān)利用rpsL基因進(jìn)行細(xì)菌耐藥性的研究進(jìn)行得很多,但是還沒有利用該系統(tǒng)定量測定化合物的致突變性。常用的致突變性評測系統(tǒng)主要采用哺乳類細(xì)胞正向突變實(shí)驗(yàn),即HPRT基因突變試驗(yàn)和TK基因突變實(shí)驗(yàn)[10-11]。但是這些實(shí)驗(yàn)均需要復(fù)雜的哺乳細(xì)胞培養(yǎng)條件,且實(shí)驗(yàn)過程大多在10 d以上。采用rpsL系統(tǒng)進(jìn)行檢測,整個(gè)分析過程可以在24 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)rpsL分析背景較低,如TK基因的自發(fā)突變率為10-5[11],而rpsL的自發(fā)突變率低至10-6,遠(yuǎn)低于同類正向篩選體系。此外,采用rpsL正向選擇系統(tǒng)進(jìn)行丙烯酰胺導(dǎo)致的突變性的評價(jià)不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件,節(jié)省人力物力。因此rpsL基因突變實(shí)驗(yàn)有望成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中致癌物快速檢測的有效工具。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Application ofrpsLMutation Assay for Mutagenicity with Acrylamide

LIU Qing-dai, WANG Zhi-wei, AN Hong-jie, ZHANG Zhi-zhou
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)

In this study,rpsLmutation assay was use as model to determine the mutagenicity induced by acrylamide.E.coliMF101 carried with pMOL21 was treated with different concentrations of acrylamide(0.05,0.10,0.25,0.50,1.00 mg/mL,respectively).The results showed that with the increasing of the acrylamide concentration,rpsLmutation frequency significantly increases.Furthermore,a dosage-dependent relationship was detected.The results present here strong suggested that therpsLmutation assay may be as a potential tool for investigating food and drug safety.

rpsLmutation assay,acrylamide,mutagenicity

TS 201.6

:A

1673-1689(2010)02-0298-04

2009-07-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800255);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃;天津科技大學(xué)人才引進(jìn)基金項(xiàng)目(20060432,20060424)。

劉清岱(1975-),男,滿族,河北保定人,講師,理學(xué)博士,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。Email:lqd@tust.edu.cn。