堿—酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究

吳楓楠

(吉林龍谷生物科技有限公司,吉林 132101)

堿—酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究

吳楓楠

(吉林龍谷生物科技有限公司,吉林 132101)

研究以豬軟骨組織為原料,采用堿液提取和酶解相結(jié)合的方式提取硫酸軟骨素。通過對影響堿液提取效率和酶解效果因素的研究,確定了堿液提取的最佳條件為:堿液的體積分?jǐn)?shù)7.5%、提取溫度為50℃、提取時間2 h、提取2次。酶解的最佳條件為:采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶1∶1(w∶v)、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%,p H值8、提取36 h。

硫酸軟骨素;堿—酶法;木瓜蛋白酶;胰蛋白酶;豬軟骨

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate,簡稱CS)是存在于動物軟骨組織中的多種酸性多糖的混合物,主要通過共價鍵與核心蛋白質(zhì)相連,以蛋白聚糖的形式存在。具有多種同分異構(gòu)體,根據(jù)硫酸基在半乳糖上的位置不同主要分為硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素B(CSC)[1]。

硫酸軟骨素具有多種生物活性。由于硫酸軟骨素具有降低血脂、抗病毒、提高免疫力、抗衰老等功能,被廣泛應(yīng)用于臨床和生物醫(yī)學(xué)中。

硫酸軟骨素的提取方法主要有:高溫高壓、中性鹽法、堿法、酶解法等,本文采用堿法和酶解法相結(jié)合的辦法,著重對影響提取的關(guān)鍵步驟進(jìn)行了研究,從而得到一條優(yōu)化的生產(chǎn)途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

豬軟骨組織(市售),活性炭,胰蛋白酶(活力1∶250),木瓜蛋白酶(活力1∶3 000),胃蛋白酶(活力1∶3 000)。

721型分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠; DHG-06型系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;LD4_2A型電動離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;PHS—25型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠;抽濾機(jī),JA2002電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生產(chǎn)工藝流程

1.2.2 最佳工藝條件的確定方法

1)堿液提取條件的確定方法 由于硫酸軟骨素通過共價鍵與核心蛋白相連接,以蛋白糖的形式存在,因此需以某種方法使共價鍵斷裂,從而使硫酸軟骨素釋放出來,而堿液可較好的使共價鍵破裂,而且硫酸軟骨素分子上的硫酸基比較穩(wěn)定,在堿液作用下硫酸軟骨素分子結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量一般不會發(fā)生變化,因此本實(shí)驗(yàn)采用加入堿液的辦法提取硫酸軟骨素。實(shí)驗(yàn)中以影響堿提效果的主要因素:堿液濃度,提取時間,提取次數(shù),提取溫度為試驗(yàn)因子,采用正交試驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2)酶解條件的確定方法 為進(jìn)一步提高硫酸軟骨素的提取效果,同時提高產(chǎn)品的純度,本實(shí)驗(yàn)采用外加蛋白酶的辦法去除蛋白質(zhì)。首先通過單因素試驗(yàn)確定最佳的分解酶,然后在酶確定的基礎(chǔ)上,通過以影響酶解的主要因素:酶解溫度、p H、酶的添加量、酶解時間為試驗(yàn)因子進(jìn)行正交試驗(yàn),對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化[3]。

3)活性炭吸附 酶解后酶解液p H值在8左右,滴加鹽酸調(diào)節(jié)水解液p H值至6.5～7.0,溫度控制在50℃,在攪拌下1∶1(W/V)加入顆粒狀活性炭,攪拌吸附1h,然后用鹽酸調(diào)節(jié)p H值為5.0～5.5,并加入2 g/dL量的氯化鈉,升溫近至(85℃左右)保溫30 min,趁熱用8層紗布過濾,濾液再用濾紙過濾兩次得澄清的硫酸軟骨素液。

4)純化脫色 在經(jīng)活性炭吸附后的溶液中加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%～70%并靜置過夜,次日可得膠狀沉淀。所得沉淀用無水乙醇及丙酮各洗滌2～3次,然后過濾,濾渣置60～65℃的真空干燥箱中干燥,即得白色的硫酸軟骨素粉[4]。

1.3 分析方法

蛋白質(zhì)含量的測定:Folin-酚試劑法

產(chǎn)品總得率(%)=(干品硫酸軟骨素的質(zhì)量(g)/干燥豬軟骨組織的質(zhì)量(g)×100%[5]

游離氨基酸總量:茚三酮比色法[6]

2 結(jié)果與討論

2.1 堿液提取條件的確定

準(zhǔn)確稱取9份50g∕份的軟骨組織粉末于500 mL的燒杯中,在料液比為1∶2的基礎(chǔ)上,以堿液濃度、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)(見表1,2)。

由表1,2可知:影響堿液提取的因素依次為: B>A>C>D,即堿液濃度對提取的影響最大,提取溫度次之,而提取時間和提取次數(shù)對提取的影響相對較小。在料液比為1∶2時堿液提取的最佳組合為A2B2C2D1即:提取溫度50℃、堿液體積分?jǐn)?shù)7.5%、提取2次、提取時間24 h。

表1 堿液提取的因素水平表Tab.1 Factors and levels form of alaklin extraction

表2 堿液提取的正交試驗(yàn)表Tab.2 Orthogonal test table of alkali extraction

2.2 酶解條件的確定

2.2.1 酶種類的選擇 硫酸軟骨素與核心蛋白以共價鍵相連。堿液提取后,為進(jìn)一步將蛋白質(zhì)降解,使硫胺素釋放出來,本實(shí)驗(yàn)采用各種不同的蛋白酶進(jìn)行降解試驗(yàn),從而確定最佳分解酶。準(zhǔn)確稱量4份50∕份的軟骨組織粉末于500 mL的燒杯中,在p H值8.0、溫度55℃、酶添加量為1.5%的情況下提取24 h,然后采用茚三酮與游離氨基酸的顯色反應(yīng)確定蛋白質(zhì)的降解程度。

表3 酶種類的選擇Tab.3 The selccfion of enzyme

由表3可知:在相同的作用條件下,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶作用效果最好,而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的作用效果次之且相似,胃蛋白酶的效果較差。因此本實(shí)驗(yàn)采用添加木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶(1∶1)的方法提取硫酸軟骨素。

2.2.2 酶解條件的確定

在酶的種類確定的情況下,準(zhǔn)確稱取9份50g∕份的軟骨組織粉末于500 mL的燒杯中,以影響酶解的四個因素:酶解溫度、p H、添加量、酶解時間進(jìn)行正交試驗(yàn)(見表4,5)。

由表4,5可知:各因素對酶解的影響依次為:A >B>C>D,即酶解的溫度對酶解效果的影響最大,酶的添加量次之,酶解的p H和酶解時間影響相對較小。通過極差分析得最佳的酶解條件為A1B2C1D2,即酶解溫度為45℃、混合酶添加量為1.0%、酶解p H為8、酶解時間36 h。

表4 酶解正交試驗(yàn)因素水平表Tab.4 Factors and levels from of enzyme hydrolysis

表5 酶解的正交試驗(yàn)表Tab.5 Orthogonal test of enzyme hydrolysis

3 結(jié) 語

1)本文研究以豬軟骨組織為原料,通過預(yù)處理等工序制得軟骨組織粉末,然后在不同的條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),從而確定了堿液提取的最佳條件為:堿液體積分?jǐn)?shù)7.5%、提取溫度50℃、提取時間24 h,提取2次,酶解的最佳條件為:以木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶為降解酶,在溫度為45℃、pH值為8、混合酶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的條件下酶解時間36 h。

2)最終產(chǎn)品呈白色、略帶咸味、無臭,具有較強(qiáng)的吸水性,加熱不凝結(jié),易溶于水并形成粘稠溶液,不溶于酒精、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑。

3)主要檢測結(jié)果為產(chǎn)品總得率為24.4%、硫酸軟骨素質(zhì)量分?jǐn)?shù)92%、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.35%、含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.72%、酸堿度為6.5。

[1]盧學(xué)根.羊軟骨粘多糖的酶法提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2007(10)184-185.

LU Xue-gen:The research of extraction technology of chondroitin sulfate mucopolysaccharides with enzymes from eggshell membrane[J].Science and Technology of Food Industry,2007(10)184-185.(in Chinese)

[2]武中會.堿液對牦牛軟骨素提取硫酸軟骨素工藝的影響[J].獸禽業(yè),2008(6).

WU Zhong-hui.Influence on craft of the lye about extract the chs from yak’s cartilage[J].Livestock and Poultry Industry, 2008(6).(in Chinese)

[3]劉國慶,凌慶枝,孫軍飛.蛋殼膜硫酸軟骨素的提取工藝及其優(yōu)化[J].食品科學(xué),2007(9)283-285.

LIU Guo-qing,LING Qing-zhi,SUN Jun-fei.Optimization of extraction technology of chondroitin sulfate from eggshell membrane[J].Food Science,2007(9)283-285.(in Chinese)

[4]趙培城,高紅林,朱順達(dá).豬硫酸軟骨素提取工藝研究[J].食品科學(xué),2004(4)14-17.

ZHAO Pei-cheng,GAO Hong-lin,ZHU Shun-da.Study on the extraction technology of the chondroitin sulfate of pig[J]. Food Science,2004(4)14-17.(in Chinese)

[5]舒坤賢,等.中華鱘硫酸軟骨素提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2006(3)151-155.28-30.

SHU Kun-xian.study on the extraction technology of chondroitin sulfate from aclpenser sinensis grdy cartilage[J].Science and Technology of Food Industry,2006(3)151-155.28-30.(in Chinese)

[6]大連輕工業(yè)學(xué)院,華南理工大學(xué)等合編[M].食品分析,中國輕工業(yè)出版社,2002.

(責(zé)任編輯:楊萌)

Extraction of Sulphuric Acid Cartilage Biotin by Alkali-Enzyme Process

WU Feng-nan
(Rongoo Jilin Biological Technology Co.Ltd.,Jilin 132101,China)

This aims of this study is to develop an efficient extraction process of chondroitin sulfate from pig cartilage by Alkali-enzyme hydrolysis.For this,the optimum conditions were determined and listed as follows:Density 7.5%,Temperature 50℃,Time 2 h,two times.the optimum conditions to extracted enzyme are as follow:Mixed enzyme with quince protein enzyme and trypsin(1∶1)、Additive Quantity:1.0%,p H=8、Extracting 36 h.

chondroitin sulfate,alkali-enzyme method,quince protein enzyme,trypsin,pig cartilage

Q 81

:A

1673-1689(2010)01-0081-03

2008-11-04

吳楓楠(1982-),男,蒙古族人,吉林人,助理工程師,主要從事生物技術(shù)研究及新產(chǎn)品研發(fā)工作。Email:wunan8866@163.com