• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    味蕾細(xì)胞的Percoll梯度離心純化技術(shù)研究

    2010-08-27 11:13:02王騰浩秦玉梅張根華鄧少平
    關(guān)鍵詞:密度梯度味蕾懸液

    王騰浩, 秦玉梅, 張根華, 鄧少平*

    (1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

    味蕾細(xì)胞的Percoll梯度離心純化技術(shù)研究

    王騰浩1, 秦玉梅1, 張根華2, 鄧少平*1

    (1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

    以ICR小鼠的菌狀味蕾細(xì)胞為研究對(duì)象,利用Percoll梯度離心技術(shù)純化小鼠菌狀味蕾細(xì)胞,通過臺(tái)盼藍(lán)染色和免疫組織化染色方法分別比較純化前后的味蕾細(xì)胞存活率與純度的變化,應(yīng)用透射電鏡從超微結(jié)構(gòu)鑒定味蕾細(xì)胞。結(jié)果顯示:通過不連續(xù)的Percoll密度梯度離心法對(duì)味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化,細(xì)胞分層效果明顯,主要位于體積分?jǐn)?shù)20%與40%的Percoll工作液之間;免疫組化結(jié)果表明:純化后味蕾細(xì)胞的純度顯著提高,從10%提高到65%(P<0.01),臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示:純化后細(xì)胞活度達(dá)94%,電鏡則從超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)了純化的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞。

    味蕾細(xì)胞;純化技術(shù);Percoll;超微結(jié)構(gòu)

    味蕾是哺乳動(dòng)物味覺的主要感覺器,主要分布在舌、上軟腭、咽、喉和食道上部[1]。舌上皮中有4種不同空間分布的舌乳頭(lingual papille):絲狀乳頭(filiform papillae,FI)、菌狀乳頭(fungiform papillae,FF)、葉狀乳頭(foliate papillae,FL)和輪廓狀乳頭(circumvallate papillae,CV),其中FF、CV、FL乳頭因含味蕾而被稱為味乳頭(gustatory papillae)[2]。FF乳頭主要位于舌前部三分之二的區(qū)域,哺乳動(dòng)物的每個(gè)FF乳頭含一到多個(gè)味蕾[3]。每個(gè)味蕾有50~150個(gè)細(xì)胞組成,這些細(xì)胞根據(jù)其超微結(jié)構(gòu)特征將這些細(xì)胞分為4種類型[4]:Ⅰ型細(xì)胞(暗細(xì)胞)、Ⅱ型細(xì)胞(亮細(xì)胞)、Ⅲ型細(xì)胞(中間細(xì)胞)和Ⅳ型細(xì)胞(基細(xì)胞)。其中Ⅱ型和Ⅲ型細(xì)胞被認(rèn)為是味覺感受細(xì)胞,已成為味覺生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著味蕾細(xì)胞分離方法的建立和發(fā)展,味蕾細(xì)胞的研究已經(jīng)取得長足的進(jìn)展。如何獲取大量高純度、高活性的味蕾細(xì)胞仍是亟待解決的問題。

    味蕾細(xì)胞是特化的上皮細(xì)胞,對(duì)微環(huán)境的要求比較嚴(yán)格,且細(xì)胞在形成之后平均每十天更新一次,而培養(yǎng)的味蕾細(xì)胞不具備增殖功能[7],故很難通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法來獲取大量味蕾細(xì)胞?,F(xiàn)在味蕾細(xì)胞的分離技術(shù)相對(duì)較少,主要有直接分離法、微吸管吸取法和兩步酶解法[5,6],所分離的細(xì)胞在數(shù)量和純度上均尚難以滿足對(duì)味蕾細(xì)胞離體研究的需要。作者通過酶-機(jī)械法獲取細(xì)胞懸液,使用不連續(xù)的Percoll密度梯度離心法分離純化味蕾細(xì)胞,通過優(yōu)化條件建立了一套有效的味蕾細(xì)胞分離純化技術(shù),為離體味蕾細(xì)胞生理生化特性及味蕾細(xì)胞傳感器研究提供了一定的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周ICR小鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.1.2 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素與鏈霉素均購自Gibco公司;MCDB 153、膠原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)、中性蛋白酶Ⅱ(dispaseⅡ)、胰島素(insulin)均購自Sigma公司;HEPES購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司、細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin,CK8)購自Epitomics公司,即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,其他試劑均為分析純。1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配制 參考Ozdener等[8]的培養(yǎng)基配置方法,IMDM培養(yǎng)基中添加10% FBS,1:5 MCDB 153,50 ng/mL胰島素和100 U/ mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

    Tyrode溶液:NaCl 7.65 g,KCl 0.37 g,CaCl20.89 g,MgCl20.20 g,HEPES 2.38 g,葡萄糖1.80 g,丙酮酸鈉1.10 g,NaHCO30.42 g,p H 7.4。無鈣Tyrode溶液,省略CaCl2。

    1.2 方法

    1.2.1 味蕾細(xì)胞懸液的制備 取6~8周ICR小鼠CO2致死,斷頭后取舌,舌剪至CV狀乳頭邊緣處。Tyrode溶液清洗舌頭表面的血跡,清洗完畢放入無鈣Tyrode溶液中。用5 ml一次性注射器將0.1~0.3 mL的混合酶液(1∶1混合的1 mg/ml膠原酶Ⅱ+3 mg/ml中性蛋白酶Ⅱ)注入舌上皮與其下的肌肉層之間,注射器針頭要一直伸至舌尖邊緣后緩慢地注射酶液至舌腫脹,舌背面和側(cè)面少量多次注射酶液。無鈣Tyrode溶液中孵育4~6 min,用眼科鑷將上皮與肌肉層輕輕剝離。將剝離的上皮迅速放入新的Tyrode溶液中,用眼科剪將含有FF乳頭的舌前部1/3區(qū)域剪下,置于冰浴中的Tyrode溶液中備用。將含有FF乳頭的上皮切成大約1 mm2的小碎片,放入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶和0.05%EDTA消化液的培養(yǎng)皿內(nèi),37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化5~10 min,得細(xì)胞懸液。

    1.2.2 Percoll離心液梯度分離

    1)Percoll工作液的制備 將Percoll母液和Percoll稀釋液按表1所列方案配制Percoll各密度梯度溶液。用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí),可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。

    2)裝樣 樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異,一般加樣體積不宜過大,細(xì)胞濃度也不可過高,否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。

    3)Percoll離心液梯度的選擇 參考Seta等[9]的方法(1997)并對(duì)Percoll工作液進(jìn)行改進(jìn),簡要過程為:先通過在50 mL離心管中加入各種濃度的Percoll工作液各3 mL,濃度從高到低鋪于管中,后加入4 mL 1×107~1×108個(gè)/mL細(xì)胞懸液,觀察細(xì)胞主要集中區(qū)域,選取細(xì)胞分離純化的Percoll梯度濃度。通過實(shí)驗(yàn)選取得出用于純化味蕾細(xì)胞的Percoll工作液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%、40%和20%。用選取的濃度梯度采用兩次離心法對(duì)味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化。如圖1為3層不同密度的Pecoll液疊加時(shí)的實(shí)物圖。從下到上分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、40%和20%的Percoll溶液。

    表1 Percoll工作液配制表Tab.1 Preparation of Percoll solution of different concentration

    圖1 不同密度Percoll溶液疊加圖Fig.1 Discontinuous gradients of three Percoll working solution with the concentration of 70%,40% and 20%from top to bottom

    4)味蕾細(xì)胞的純化 將細(xì)胞懸液鋪于上述不連續(xù)密度梯度的Pecoll分離液中,在離心管中先靜置30 min,然后25℃下1 200 r/min離心6 min。分離的細(xì)胞絕大部分位于在兩層Percoll工作液的交界面時(shí),逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞。收集含有Percoll液的細(xì)胞用培養(yǎng)培養(yǎng)液洗滌兩次,計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度后備用。

    1.2.3 ABC免疫組化評(píng)估味蕾細(xì)胞的純度 制作細(xì)胞爬片,體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛4℃固定60~90 min。室溫1份體積分?jǐn)?shù)30%H2O2與50份純甲醇的混合液中浸泡30 min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水1~2次。后按博士德試劑盒說明操作。DAB顯色封片后普通光學(xué)顯微鏡下觀察。所使用一抗為兔抗CK8的單克隆抗體,稀釋度1∶500。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照,一抗用PBS代替。

    1.2.4 味蕾細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)鑒定 純化的細(xì)胞懸液1 000 r/min離心4 min,去上清,將細(xì)胞懸浮于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜。倒掉固定液,用0.1 mol/L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鋨酸溶液固定樣品1~2 h。倒掉固定液,用0.1 mol/ L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min。用梯度體積分?jǐn)?shù)(50%,70%,80%,90%和95%)的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理各15 min,再用100%的乙醇處理一次20 min,最后過度到純丙酮處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=1∶1處理樣品1 h,然后用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=3∶1處理樣品3 h,純包埋劑處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來,70℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片,獲得70~90 nm的切片,該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇飽和溶液各染色15 min,用日本J EOL公司的J EM-1230型透射電鏡觀察。

    1.2.5 味蕾細(xì)胞活力測定 用臺(tái)盼藍(lán)染色法測定味蕾細(xì)胞的活力。將純化前、后的味蕾細(xì)胞懸液的密度各調(diào)至1×106/mL,取9滴細(xì)胞懸液滴入試管,加入1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色,混勻,滴在計(jì)數(shù)板上。此時(shí)由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞被染成紫藍(lán)色,而活細(xì)胞不被染色。3 min內(nèi)在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)版分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量,按下式計(jì)算味蕾細(xì)胞的存活率。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同梯度層味蕾細(xì)胞形態(tài)和活力

    實(shí)驗(yàn)采用離心前將細(xì)胞懸液在離心管中先靜置30 min,使細(xì)胞懸液中的味蕾細(xì)胞下沉,以提高分離效果。25℃、1 200 r/min離心6 min,離心后細(xì)胞主要集中在各濃度液面交界處,各層內(nèi)部細(xì)胞分布較少。各個(gè)細(xì)胞聚集層的細(xì)胞形態(tài)有明顯差異,如圖2所示,原細(xì)胞懸液中混有大量雜細(xì)胞和上皮碎片(圖2(A),且活性相對(duì)較低,計(jì)數(shù)1 895個(gè)細(xì)胞,其中413個(gè)臺(tái)盼然染色陽性,成活率為78.21%,經(jīng)純化后體積分?jǐn)?shù)20%Percoll溶液與40%Percoll溶液的液面交界處的分離物以梭形細(xì)胞為主,混有少量圓形細(xì)胞和扁平細(xì)胞(圖2(C)),從形態(tài)上判斷味蕾細(xì)胞主要集中在這一層,將位于此層的細(xì)胞清洗重懸再純化,混雜細(xì)胞的數(shù)量會(huì)進(jìn)一步減少。20%與原液層之間主要為一些內(nèi)徑在5~10μm且大小均勻的圓形細(xì)胞(圖2(B)),最下層的交界面則較多地聚集了一些內(nèi)徑為20~30μm的細(xì)胞(圖2(D)),離心管底部有大塊的上皮碎片。參照表1數(shù)據(jù)可知小鼠味蕾細(xì)胞的密度主要集中在1.03-1.06 g/mL之間,比Seta[10]得出的大鼠的密度要小,并且介于外周非味覺上皮細(xì)胞的密度之間。純化后細(xì)胞活性有較大提高(計(jì)數(shù)了2 478個(gè)細(xì)胞,其中131個(gè)臺(tái)盼藍(lán)著色陽性,成活率為94.71%),主要原因可能是因?yàn)榧兓昂写罅糠俏队X上皮細(xì)胞,這些細(xì)胞在分離過程過受損所致。上述結(jié)果證明了Percoll梯度離心純化味蕾細(xì)胞有利于提高味蕾細(xì)胞的活性。

    圖2 Percoll離心后各細(xì)胞聚集層細(xì)胞形態(tài):(A)細(xì)胞原液,(B)20%與原液交界面,(C)20%~40%交界面,(D)40%~70%交界面Fig.2 Cell morphology of different layers after Percoll centrifugation:original cell samples(A),interface between 20%Percoll and cell samples(B), interface between 20%and 40%Percoll(C), interface between 40%and 70%Percoll(D)

    2.2 ABC免疫組化定量判定味蕾純化前后細(xì)胞濃度

    味蕾細(xì)胞起源于上皮細(xì)胞,是一種簡單的柱狀上皮細(xì)胞,被周圍的復(fù)麟質(zhì)狀上皮細(xì)胞所包圍。有5種CK分子(CK 7、8、18、19和20)在正常的味蕾細(xì)胞中表達(dá),但在其周圍的非味覺細(xì)胞中不表達(dá)。其中CK 8在大量味蕾細(xì)胞表達(dá),是一種良好的成熟和正在成熟的味蕾細(xì)胞的分子標(biāo)記[11]。與其他成熟的味蕾細(xì)胞的標(biāo)記(α-gustducin,PLCβ2, NCAM等)相比,CK 8能夠更充分的表明混雜細(xì)胞中味蕾細(xì)胞的純度。如圖3(A),省略一抗時(shí)味蕾細(xì)胞沒有陽性反應(yīng),以證明此抗體的特異性。從圖3(B)和圖3(C)中可以看出純化后陽性味蕾細(xì)胞的數(shù)量顯著多于純化前,通過計(jì)數(shù)得知純化前陽性味蕾細(xì)胞數(shù)少于10%(8.59±1.29,n=10),而純化后陽性味蕾細(xì)胞數(shù)量顯著提高(P<0.01),大約占細(xì)胞總數(shù)65%(65.7±2.11,n=12)。造成純化后味蕾純度不太理想的原因可能因?yàn)槲独偌?xì)胞分為4種類型,迄今還沒有那種標(biāo)記物能夠完全標(biāo)記所有類型味蕾細(xì)胞。

    圖3 純化前后味蕾細(xì)胞的CK8免疫組化。(A)陰性對(duì)照,(B)和(C)分別為純化前后味蕾細(xì)胞的CK8免疫組化Fig.3 Immunohistochemistry of CK8 for TBCs before(B)and after(C)purification;the negative contrast is showed in(A)

    2.3 味蕾細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)鑒定

    圖4 分離味蕾細(xì)胞的透射電鏡圖片,(A)橫切面圖, (B)縱切面圖Fig.4 Transverse section(A)and longitudinal section (B)of an iolated taste bud cell by transmission electron microscopy

    味蕾細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也是識(shí)別味蕾細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志,每種類型細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),純化后細(xì)胞的透射電鏡結(jié)果如圖4所示,圖4 (A)圖為細(xì)胞的橫切面,胞漿中含有豐富的微絲和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞核形狀不規(guī)則,含有大量的異染色質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中存在許多100~400 nm的致密團(tuán)粒結(jié)構(gòu)(如箭頭所示),這是I型細(xì)胞的顯著結(jié)構(gòu)特征,I型細(xì)胞是暗細(xì)胞,呈紡錘形,味蕾中其數(shù)量最多。圖4(B)為細(xì)胞的縱切面,細(xì)胞呈梭形,胞漿透亮,具有圓形細(xì)胞核,細(xì)胞頂部細(xì)胞質(zhì)不含有致密顆粒,這是II型細(xì)胞的特點(diǎn)。細(xì)胞純化技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基本技術(shù)之一,它主要是根據(jù)細(xì)胞本身的某些性質(zhì)來分離具有同一性狀的細(xì)胞群。細(xì)胞的分離方法有很多種,常用的細(xì)胞分離純化方法有:速度沉降分離法;等密度沉降分離法;流式細(xì)胞分離儀分離法;免疫磁珠分離法等[12]。與需要抗體的流式細(xì)胞分離儀分離法和免疫磁珠分離法相比,Percoll密度梯度離心方法操作簡單方便,成本低,一次處理細(xì)胞數(shù)量多。Percoll是一種外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅膠顆粒,以它作為密度梯度分離劑的優(yōu)點(diǎn)是無毒,無刺激性,對(duì)細(xì)胞無吸附作用,產(chǎn)生的滲透壓很小,在全部密度范圍保持相等張力。Percoll密度梯度離心法主要根據(jù)細(xì)胞之間密度差異分離細(xì)胞。細(xì)胞在連續(xù)密度梯度的分離介質(zhì)中,受強(qiáng)離心力的作用,最后會(huì)到達(dá)與其密度相同的分離介質(zhì)層面,并能保持平衡。在非連續(xù)的梯度中,分離的細(xì)胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度交界面上或密度層內(nèi)。

    實(shí)驗(yàn)通過采用Percoll密度梯度離心法對(duì)小鼠味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化,獲得了較好的效果,純化后的細(xì)胞純度在65%以上(P<0.01),而且細(xì)胞存活率達(dá)到94.71%。細(xì)胞經(jīng)消化后形態(tài)趨于圓形,培養(yǎng)后味蕾細(xì)胞的形態(tài)異于體內(nèi)形態(tài)。為了證明培養(yǎng)的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞,通過透射電鏡技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定,結(jié)果從精細(xì)結(jié)構(gòu)上證明了純化的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞。但由于味蕾細(xì)胞包含4種類型的細(xì)胞,而CK 8不能標(biāo)記所有味蕾細(xì)胞,這也許是導(dǎo)致純化后細(xì)胞純度偏低的主要原因。

    3 結(jié) 語

    總之,作者已經(jīng)初步建立了一種有效的小鼠味蕾細(xì)胞分離純化方法,通過Percoll密度梯度離心法從小鼠舌上皮組織中富集形態(tài)和活力良好的味蕾細(xì)胞。應(yīng)用純化的味蕾細(xì)胞可以開展甜味感受熱力學(xué)和細(xì)胞傳感器方面的研究,并結(jié)合膜片鉗和鈣影像技術(shù)研究味蕾細(xì)胞的生理生化特性。

    [1]Jung H S,KEIICHI AKITA,KIM J Y.Spacing patterns on tongue surface-gustatory papilla[J].Int J Dev Biol,2004,48 (2-3):157-161.

    [2]Bigiani A,Delay RJ,Chaudhari N,et al.Responses to glutamate in rat taste cells[J].The Journal of Neurophysiology, 1997,77(6),3048-3059.

    [3]Chandrashekar J,Hoon M A,Ryba N J,et al.The receptors and cells for mammalian taste[J].Nature,2006,444 (7117):288-294.

    [4]Doty R L.Handbook of olfaction and gustation[M].New York:Madison Avenue press,2003:707-718.

    [5]Kinnamon S C,Cummings T A,Roper S D.Isolation of single taste cells from lingual epithelium[J].Chem Senses, 1988,13:355-366.

    [6]Thomas E F.Cell Types and Lineages in Taste Buds[J].Chem Senses,2005,30(Suppl 1):i54-i55.

    [7]Farbman AI.Renewal of taste bud cells in rat circumvallate papillae[J].Cell Tissue Kinet,1980,13(4):349-357.

    [8]Ozdener H,Yee K K,Cao J,et al.Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture[J].Chem Senses,2006,31(3):279-290.

    [9]Seta Y,Harada H,Toyoshima K.Isolation,partial purification,and ultrastructure of taste bud cells from rabbit foliate papillae[J].Neurosci Lett,1997,227(1):61-64.

    [10]Seta Y,Toyono T,Takeda S,et al.Expression of Mash1 in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependent upon gustatory innervation[J].FEBS Lett,1999,444:43-46.

    [11]Zhang C,Oakley B.The distribution and origin of Keratin 20 containing taste buds in rat and human[J].Differentiation, 1996,61:121-127.

    [12]姜俊芬,韓偉.動(dòng)物組織細(xì)胞分離純化方法學(xué)[J].解剖學(xué)雜志,2006,29(6):799-802.

    Jiang Jun-Feng,Han Wei.Methodology on separation and purification of animal tissues and cells[J].Chinese Journal of Anatomy,2006;29(6):799-801.(in Chinese)

    (責(zé)任編輯:朱明)

    Development of a Discontinuous Percoll Gradient Centrifugation Process for Taste bud Cells Purification

    WANG Teng-hao1, QIN Yu-mei1, ZHANG Gen-hua2, DENG Shao-ping*1
    (1.College of Food Science and Biotechnology Engineering,Sensory Science Laboratory,Zhejiang Gongshang Uni
    versity,Hangzhou 310035,China;2.College of Food Science and Biotechnology,Changshu Institute of Technolo
    gy,Changshu 215500,China)

    In this manuscript,the taste bud cells of fungiform papillae of ICR mice were select as research model and Percoll gradient centrifugation was used as purify method.The methods of trypan blue staining and immunohistochemistry staining were performed to compare the viability and purity of taste bud cells of before and after purification respectively.Taste bud cells were further identified by transmission electron microscopy.Results showed that taste bud cells, which were purified by discontinuous Percoll gradient centrifugation,were remarkably separated and mainly located interface between 20%and 40%Percoll working solution;the purity of taste bud cells were distinctly improved from less than 10%to more than 65%(p<0.01)by this treatment;the viability of taste bud cells were up to 94%after purification by trypan blue staining and the results of transmission electron microscopy further confirmed taste bud cells from ultrastructure.

    taste bud cells,purification technology,Percoll,ultrastructure

    Q 434

    :A

    1673-1689(2010)01-0118-05

    2009-03-03

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770536);浙江省科技廳新苗人才項(xiàng)目(2008R40G2050028);浙江工商大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金(1110XJ1508066).

    *通訊作者:鄧少平(1956-),男,江西新干人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品感官科學(xué)方面的研究。Email:spdeng@zjgsu.edu.cn

    猜你喜歡
    密度梯度味蕾懸液
    TPMS點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的密度梯度雜交優(yōu)化設(shè)計(jì)
    中國首臺(tái)準(zhǔn)環(huán)對(duì)稱仿星器中離子溫度梯度模的模擬研究*
    味蕾大作戰(zhàn)
    趣味(語文)(2020年10期)2020-07-21 05:31:50
    退化的“味蕾”
    磺胺嘧啶銀混懸液在二度燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用
    對(duì)Meselson和Stahl半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)的解析
    味蕾貴州
    薯蕷皂苷元納米混懸液的制備
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:28
    八月,跟著味蕾去旅行!
    霧化吸入布地奈德混懸液治療COPD急性加重期的效果觀察
    精品欧美国产一区二区三| 成人二区视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美精品国产亚洲| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产成人精品久久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 少妇的逼水好多| 韩国高清视频一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 免费av毛片视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美日韩在线观看h| 日韩中字成人| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久久亚洲| 日韩精品有码人妻一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 美女大奶头视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日日撸夜夜添| 国产av不卡久久| 综合色av麻豆| 激情 狠狠 欧美| 最近视频中文字幕2019在线8| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 熟女电影av网| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产乱人视频| eeuss影院久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产一区二区三区av在线| 国产 一区精品| 边亲边吃奶的免费视频| 熟女电影av网| 91久久精品电影网| 亚洲av日韩在线播放| 欧美精品一区二区大全| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲成色77777| av福利片在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产不卡一卡二| 日韩三级伦理在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 国产高清有码在线观看视频| 国产精华一区二区三区| 欧美3d第一页| 久久99热6这里只有精品| 99热这里只有是精品在线观看| 韩国av在线不卡| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩国产亚洲二区| 波野结衣二区三区在线| 日本黄大片高清| 久久精品人妻少妇| 村上凉子中文字幕在线| 99久久精品热视频| 亚洲国产欧美在线一区| av在线天堂中文字幕| 色播亚洲综合网| 亚洲国产色片| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品伦人一区二区| 99热这里只有精品一区| 国产久久久一区二区三区| 欧美高清性xxxxhd video| 我的女老师完整版在线观看| www日本黄色视频网| 搡女人真爽免费视频火全软件| 26uuu在线亚洲综合色| 亚州av有码| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 色播亚洲综合网| 美女内射精品一级片tv| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲成人久久爱视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久久久国产电影| 又爽又黄a免费视频| 国产色爽女视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩国内少妇激情av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产黄片美女视频| 亚洲成人av在线免费| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲成人精品中文字幕电影| 人人妻人人澡欧美一区二区| 热99在线观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 嫩草影院新地址| 性色avwww在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文字幕制服av| 联通29元200g的流量卡| 国产成人一区二区在线| 插逼视频在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 深夜a级毛片| 亚洲精品乱久久久久久| h日本视频在线播放| av视频在线观看入口| 欧美+日韩+精品| 身体一侧抽搐| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲最大成人手机在线| 少妇的逼好多水| 成人午夜高清在线视频| 久久久久网色| 别揉我奶头 嗯啊视频| kizo精华| 插逼视频在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲美女视频黄频| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 成人av在线播放网站| 久久久久久久国产电影| 人人妻人人看人人澡| 久久精品91蜜桃| 成人三级黄色视频| 亚洲18禁久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一本久久精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 黄色欧美视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 一区二区三区高清视频在线| 高清日韩中文字幕在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 一级黄片播放器| 亚洲av成人精品一区久久| 精品酒店卫生间| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 有码 亚洲区| 一级毛片我不卡| 99久国产av精品| 青春草视频在线免费观看| 一个人看的www免费观看视频| 婷婷色综合大香蕉| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 毛片女人毛片| 日韩欧美国产在线观看| 国产免费男女视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 丰满少妇做爰视频| 老司机福利观看| av专区在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲综合色惰| 69av精品久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲在线自拍视频| 欧美三级亚洲精品| 亚洲怡红院男人天堂| 免费观看人在逋| 亚洲国产色片| 国产色婷婷99| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 在线观看一区二区三区| 舔av片在线| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲精品自拍成人| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 国产伦理片在线播放av一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品久久久久久久性| 麻豆一二三区av精品| 日韩欧美 国产精品| 免费av毛片视频| 久久6这里有精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 麻豆一二三区av精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久精品国产自在天天线| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 两个人的视频大全免费| 亚洲av.av天堂| 丝袜美腿在线中文| 久久久国产成人精品二区| 看片在线看免费视频| av.在线天堂| 色吧在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品久久久久久久久免| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年av动漫网址| 搞女人的毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲国产色片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产黄片美女视频| 久久99蜜桃精品久久| 成人特级av手机在线观看| 简卡轻食公司| 中文字幕亚洲精品专区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品成人久久久久久| 在线免费观看的www视频| 成人特级av手机在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 97热精品久久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 少妇的逼水好多| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人福利小说| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 六月丁香七月| 免费黄网站久久成人精品| 看免费成人av毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 日本免费a在线| 日本黄色片子视频| 不卡视频在线观看欧美| 美女大奶头视频| 国产高清国产精品国产三级 | 久久久久久久久久久丰满| 欧美激情久久久久久爽电影| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久午夜福利片| av线在线观看网站| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 成人午夜高清在线视频| 18禁动态无遮挡网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本欧美国产在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一边亲一边摸免费视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品不卡视频一区二区| 国产极品天堂在线| 免费看美女性在线毛片视频| 最近的中文字幕免费完整| 99久久精品一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一级毛片电影观看 | 亚洲人成网站在线观看播放| 国产爱豆传媒在线观看| 少妇的逼好多水| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人一区二区在线| 26uuu在线亚洲综合色| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日日啪夜夜撸| 亚洲国产欧美人成| 久久草成人影院| 国产老妇女一区| 长腿黑丝高跟| 麻豆成人午夜福利视频| 免费人成在线观看视频色| 国产av码专区亚洲av| 亚洲国产精品专区欧美| 久久久国产成人免费| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产中年淑女户外野战色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 91av网一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 高清毛片免费看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 长腿黑丝高跟| 韩国高清视频一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产色片| 亚洲最大成人中文| 婷婷六月久久综合丁香| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲人成网站在线播| 全区人妻精品视频| 亚洲国产欧美在线一区| 禁无遮挡网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品福利在线免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久人妻av系列| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费观看性生交大片5| 国产大屁股一区二区在线视频| av.在线天堂| 中国国产av一级| 天堂影院成人在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产av一区在线观看免费| 一区二区三区高清视频在线| 免费观看性生交大片5| 天堂网av新在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产高清三级在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产精品永久免费网站| 我的老师免费观看完整版| 深爱激情五月婷婷| 亚洲不卡免费看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 日韩视频在线欧美| 欧美日韩精品成人综合77777| 男人的好看免费观看在线视频| 国产亚洲精品av在线| 免费av毛片视频| 99热这里只有是精品在线观看| 国产av码专区亚洲av| 天堂√8在线中文| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | av天堂中文字幕网| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产 一区精品| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲av.av天堂| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产免费视频播放在线视频 | 成人二区视频| 色综合色国产| 国产亚洲91精品色在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产黄色视频一区二区在线观看 | 欧美zozozo另类| 国产成人精品一,二区| 只有这里有精品99| 欧美成人a在线观看| 麻豆一二三区av精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99久久精品国产国产毛片| 91狼人影院| 99久久精品热视频| 热99re8久久精品国产| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 水蜜桃什么品种好| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久99热这里只有精品18| av女优亚洲男人天堂| 天天一区二区日本电影三级| 丰满人妻一区二区三区视频av| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久久久免费精品人妻一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 精品人妻熟女av久视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇的逼好多水| 久热久热在线精品观看| 欧美三级亚洲精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热这里只有精品一区| 国产午夜福利久久久久久| 综合色av麻豆| 午夜精品国产一区二区电影 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲美女搞黄在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 六月丁香七月| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av男天堂| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲色图av天堂| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品一二三区在线看| 插逼视频在线观看| 视频中文字幕在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 超色免费av| 亚洲国产最新在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日韩免费高清中文字幕av| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 美女大奶头黄色视频| 国产1区2区3区精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品自拍成人| av国产久精品久网站免费入址| 免费看不卡的av| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av码专区亚洲av| av在线播放精品| 日韩一区二区视频免费看| 日本午夜av视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 成人国产av品久久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 大话2 男鬼变身卡| 中文字幕av电影在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| av福利片在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久久久久人妻| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 婷婷色综合www| 在线精品无人区一区二区三| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产深夜福利视频在线观看| freevideosex欧美| 又黄又粗又硬又大视频| 黄色配什么色好看| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人91sexporn| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 高清欧美精品videossex| 成人免费观看视频高清| 精品第一国产精品| 人妻一区二区av| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产成人精品一,二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费看av在线观看网站| 国产精品 国内视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲国产色片| 香蕉丝袜av| 国产成人a∨麻豆精品| 国产成人一区二区在线| 久久久国产一区二区| 高清在线视频一区二区三区| 一区在线观看完整版| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本黄大片高清| av国产久精品久网站免费入址| 成年动漫av网址| 熟女av电影| 国产成人精品婷婷| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄频视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 色5月婷婷丁香| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 午夜久久久在线观看| 精品视频人人做人人爽| 国产男人的电影天堂91| 丁香六月天网| 久久久久视频综合| 午夜影院在线不卡| 黑人高潮一二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品456在线播放app| 国产 一区精品| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品自拍成人| 国产黄色视频一区二区在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品酒店卫生间| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲在久久综合| 国产精品女同一区二区软件| 欧美+日韩+精品| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久久久久成人| 久久午夜综合久久蜜桃| 97超碰精品成人国产| 两个人看的免费小视频| 亚洲,欧美精品.| 9色porny在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲,欧美,日韩| av国产精品久久久久影院| 女性生殖器流出的白浆| 一区二区三区乱码不卡18| 免费观看在线日韩| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲伊人久久精品综合| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久久伊人网av| 日本91视频免费播放| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品国产av在线观看| 视频中文字幕在线观看| 亚洲成色77777| 国产片特级美女逼逼视频| 18在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日日撸夜夜添| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产毛片在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品在线电影| 99久国产av精品国产电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产在线免费精品| 久久国内精品自在自线图片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久久久久电影网| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久鲁丝午夜福利片| 美女内射精品一级片tv| 男女免费视频国产| 少妇 在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 高清毛片免费看| 国产精品人妻久久久影院| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产精品蜜桃在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 成年动漫av网址| 久久综合国产亚洲精品| 成年人免费黄色播放视频| 好男人视频免费观看在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 在线 av 中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品一区二区三区视频在线| 免费人成在线观看视频色| 一级片'在线观看视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲人成77777在线视频| 美国免费a级毛片| 国产免费一级a男人的天堂| 51国产日韩欧美| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 高清毛片免费看| 亚洲精品乱久久久久久| h视频一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品国产av成人精品| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 男人操女人黄网站| 免费黄网站久久成人精品| av免费在线看不卡| 成年动漫av网址| 色视频在线一区二区三区| 色94色欧美一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 男的添女的下面高潮视频| 在线观看www视频免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日日啪夜夜爽| 一边亲一边摸免费视频| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色毛片三级朝国网站| 国产熟女欧美一区二区| 曰老女人黄片| 91国产中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜福利乱码中文字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲精品美女久久av网站| 精品国产国语对白av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日本av免费视频播放| 97在线人人人人妻| 国产男女内射视频| 在线精品无人区一区二区三| 精品国产国语对白av| 边亲边吃奶的免费视频|