丹參對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用機制的研究

黃 朔 ，李明振 ，張洪波 ，何其勇 ，姜 珊 ，金 琦

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科，黑龍江佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科，黑龍江佳木斯 154002；3.佳木斯大學(xué)經(jīng)濟管理學(xué)院，黑龍江佳木斯 154003）

丹參對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用機制的研究

黃 朔1，李明振1，張洪波1，何其勇1，姜 珊3，金 琦2*

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科，黑龍江佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科，黑龍江佳木斯 154002；3.佳木斯大學(xué)經(jīng)濟管理學(xué)院，黑龍江佳木斯 154003）

目的：探討丹參對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用。方法：雄性Wistar大鼠隨機分為4組，假手術(shù)組，模型組（腎臟缺血再灌注損傷），治療1組（腎臟缺血再灌注損傷前24 h給予藥物），治療2組（腎臟缺血再灌注損傷后12 h給予藥物）。雙側(cè)腎動脈夾閉22 min，制作動物模型；比色法測定血清肌酐和血清尿素氮；Western blotting檢測腎臟組織中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）的蛋白表達；TUNEL法檢測腎臟上皮細胞凋亡。結(jié)果：模型組與假手術(shù)組比較，大鼠腎臟功能明顯減退（P<0.05）；腎臟組織中，caspase-3蛋白質(zhì)表達顯著增加（P<0.05），大量腎小管上皮細胞凋亡（P<0.05）。再灌注前24 h給予藥物，能夠顯著改善腎臟功能（P<0.05），并且顯著下調(diào)caspase-3的蛋白表達（P<0.05），減輕腎臟上皮細胞凋亡（P<0.05），再灌注后12 h給藥，不能改善腎臟功能，也不能顯著下調(diào)caspase-3的蛋白表達（P>0.05）。結(jié)論：再灌注前給予丹參，能夠抑制腎臟缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的腎臟上皮細胞凋亡，對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用。

缺血再灌注損傷；腎臟；凋亡

當(dāng)前，多數(shù)學(xué)者認為，腎臟缺血再灌注損傷時，腎臟的上皮細胞會出現(xiàn)細胞凋亡，而細胞凋亡的主要途徑為，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶依賴途徑和非依賴途徑兩種[4]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶依賴途徑在腎臟的上皮細胞凋亡中發(fā)揮主要作用，在細胞凋亡中，會伴隨caspase蛋白質(zhì)家族的激活[5]。本研究著眼于丹參，作為一種傳統(tǒng)中醫(yī)藥，對腎臟缺血再灌注大鼠的腎臟上皮細胞凋亡和腎臟組織caspase-3蛋白質(zhì)表達的影響，探討丹參對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床上防治腎臟缺血再灌注損傷提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康雄性Wistar大鼠20只，年齡6～8周，重量(180±20)g，12/24晝夜周期睡眠，由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供（黑動字第99102001號，SPA方式飼養(yǎng)）。本實驗應(yīng)用的動物實驗方法，獲得了佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的許可。

血清尿素氮和血清肌酐試劑盒，采購自中生北控生物科技股份有限公司。丹參注射液購自正大青春寶藥業(yè)有限公司；caspase-3多克隆抗體（兔抗大鼠）購自美國GeneTex公司；β-actin多克隆抗體（兔抗大鼠）及羊抗兔二抗，均采購自北京康為世紀生物科技有限公司；TUNEL染色試劑盒，采購自德國BM公司。

1.2 動物模型建立

腹腔注射全身麻醉大鼠，麻醉劑為：1.25 mg/ml咪唑安定加0.08 mg/ml芬太尼，高效碘常規(guī)消毒，鋪無菌手術(shù)單，取腹部正中切口，逐層切開止血，銳性分離，找到并且分離大鼠腎蒂，無創(chuàng)傷血管夾夾閉雙側(cè)腎臟動脈，產(chǎn)生腎臟缺血，開始計時，22 min后，松開血管夾，觀察1 min，此時，腎臟的顏色由暗紅色變成鮮紅色，說明缺血再灌注模型已經(jīng)制備，逐層縫合，關(guān)閉切口，整個過程在保溫箱內(nèi)進行，溫度保持32°C，待大鼠蘇醒后，給予0.15 mg/kg鹽酸丁丙諾啡皮下注射鎮(zhèn)痛，送回實驗中心，分開飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3 標(biāo)本的留取

腹部正中切口，心臟穿刺采血，留取血清樣本，冰箱中保存，雙側(cè)腎臟離體后，用冰0.9%NaCl溶液沖洗，迅速切開，一部分置于4%甲醛中固定，另一部分置于液氮中保存。

1.4 動物分組

實驗動物分為4組：假手術(shù)組，與手術(shù)組一樣操作，不夾閉腎動脈；模型組，腎臟缺血22 min后恢復(fù)血液供應(yīng)；治療1組，腎臟缺血再灌注前24 h，給予丹參腹腔注射6.25 ml/kg；治療2組，腎臟缺血再灌注后12 h，給予丹參腹腔注射6.25 ml/kg。

1.5 腎臟功能測定

大鼠在切取腎臟標(biāo)本后，心臟穿刺采血，斷頸處死。應(yīng)用比色法測定大鼠血清尿素氮和血清肌酐，操作方法，按照試劑盒上的說明進行。

1.6 Western blotting測定caspase-3

將收集的腎臟組織放入1.5 ml離心管內(nèi)，加入1 ml單去污裂解液，成分為：50 mmol/L Tris(pH 7.4)（氨丁三醇），150 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100 （辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1 mmol/L(PMSF)（苯甲基磺酰氟），冰水浴中超聲勻漿，12 000xg，4℃離心15 min后，取上清液用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，進行蛋白質(zhì)電泳分析。取100 μg蛋白質(zhì)樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為12%（分離膠）和5%（積層膠），電泳結(jié)束后，將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，250 mA轉(zhuǎn)移2 h，將轉(zhuǎn)印后的膜以封閉劑（5%脫脂奶粉，含吐溫20的磷酸鹽緩沖液配制）在室溫下封閉2 h，將膜轉(zhuǎn)入含工作濃度的一抗，caspase-3(1∶200)或 β-actin（1∶1 000）中緩慢振搖1h后4℃過夜，用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5min，二氨基聯(lián)苯胺均勻涂在膜上顯色3 min，應(yīng)用quantity one(Bio-Rad)軟件進行吸光度定量，所得結(jié)果以β-actin為參考。

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End labeling(TUNEL)：終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，生物素脫氧尿苷三磷酸，刻痕末端標(biāo)記法，該方法檢測DNA片段標(biāo)記尾端核酸，通過檢測終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，生物素脫氧尿苷三磷酸，刻痕末端標(biāo)記，推斷細胞凋亡。腎臟組織用4%中性甲醛固定，過夜，脫水，透明，石蠟包埋，組織切片厚度6 μm，置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上。染色按照試劑盒的說明進行。同時做陽性與陰性對照，蘇木素再次對細胞核染色，凋亡程度以每個視野中陽性細胞數(shù)表示，每張組織切片隨機抽取8個視野，每個腎臟觀察3個切片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，任意兩組之間的比較采用SNK-q檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清尿素氮和血清肌酐的比較

見表1。模型組顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），動物模型建立成功。治療1組與模型組相比較，腎臟功能得到明顯改善，血清尿素氮和血清肌酐均明顯降低（P<0.05），治療2組與模型組相比較，腎臟功能無明顯改善（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清尿素氮和血清肌酐的比較結(jié)果（x±s）

2.2 各組大鼠腎臟組織中caspase-3蛋白質(zhì)的表達情況

Western blotting印跡結(jié)果顯示，假手術(shù)組，大鼠腎臟組織中，caspase-3活性片段的蛋白表達量很低 [caspase-3/βactin 為（0.10±0.03） mg]，模型組，蛋白質(zhì)的表達量明顯上調(diào)[caspase-3/β-actin 為（0.53±0.15） mg]，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。缺血再灌注前給藥組，蛋白質(zhì)的表達明顯低于模型組[caspase-3/β-actin 為（0.35±0.07） mg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），缺血再灌注后給藥組[caspase-3/β-actin 為（0.53±0.16） mg]，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 各組大鼠腎臟上皮細胞凋亡百分比

假手術(shù)組為(6±4)%，模型組為(36±4)%，再灌注前給藥組為(20±4)%，再灌注后給藥組為(28±6)%，模型組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；治療組與模型組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

染色顯示，假手術(shù)組的大鼠腎臟組織中，不容易找到凋亡細胞。模型組大鼠的腎臟組織中，可以發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細胞，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。再灌注前給藥組，大鼠腎臟組織中，凋亡細胞的數(shù)量與模型組比較，顯著降低（P<0.05），再灌注后給藥組，大鼠腎臟組織中，凋亡細胞的數(shù)量與模型組比較，無明顯改變（P>0.05）。

3 討論

缺血再灌注損傷，指組織或器官在缺血后，重新獲得血液灌注，對組織或器官所產(chǎn)生的損傷作用。腎臟為血液高灌注器官，對缺血和缺血再灌注都非常敏感，很容易出現(xiàn)損傷。

腎臟缺血再灌注損傷時，由于能量的消耗，生長因子缺乏，活性代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生，激活細胞凋亡途徑，引起大量腎臟上皮細胞凋亡。適度的細胞凋亡，可以使機體保持細胞數(shù)量穩(wěn)定，但過度的細胞凋亡，會使機體產(chǎn)生損傷。

對于該動物模型的制作，有的實驗室[6]應(yīng)用45 min和60 min的缺血時間，并且進行了對比，發(fā)現(xiàn)無明顯差異，本研究小組，長期應(yīng)用22 min，發(fā)現(xiàn)模型也很成功。

很多學(xué)者的研究指出，細胞凋亡的主要途徑為：caspase依賴的途徑和caspase非依賴的途徑[4，7]。在腎臟缺血再灌注損傷中，誘導(dǎo)細胞凋亡的主要是caspase依賴的途徑，包括：內(nèi)源性凋亡途徑、外源性凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，有效地抑制這些細胞途徑，將減輕腎臟缺血再灌注損傷。caspase 3的信號是一個很靈敏的檢測指標(biāo)，可以在發(fā)生細胞凋亡的8 h內(nèi)檢測到，甚至有報道在24 h內(nèi)出現(xiàn)54倍的最大值。

近些年來，有學(xué)者[8]直接在光學(xué)顯微鏡下，應(yīng)用病理學(xué)分析來判斷腎臟損傷，如，腎小管細胞腫脹，腎臟間質(zhì)水腫，髓質(zhì)充血，腎小管擴張。更加快捷，費用低廉。

丹參的記載，可以上溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為一種古老的藥物，當(dāng)代的學(xué)者在丹參對腎臟的藥理作用方面進行了許多研究[9-10]，丹參對于腎臟的保護作用已經(jīng)受到大家的重視。

本研究中，筆者采用健康雄性Wistar大鼠為腎臟缺血再灌注損傷模型。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腎臟缺血22 min后再灌注，大鼠的腎臟功能明顯減退，組織中caspase-3蛋白質(zhì)的表達明顯增加，上皮細胞凋亡明顯，證實動物模型制作成功。在缺血再灌注損傷前，給予丹參，血清尿素氮和血清肌酐，caspase-3蛋白質(zhì)的表達明顯低于模型組，上皮細胞凋亡也明顯減少，表明，在再灌注前給予丹參，有保護腎臟功能的作用，及時掌握藥物應(yīng)用的時間，可以在很大程度上減少腎臟缺血再灌注損傷。這為預(yù)防和治療腎臟缺血再灌注損傷，提供了新的思路和方法。

丹參取材容易，價格低廉，將為解決“看病難”、“看病貴”問題做出自己的貢獻，我國古老的中醫(yī)藥也必將為提高人民的健康水平而不懈努力。

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Protection of Danshen on tubular cell induced by renal ischemia reperfusion injury in rats

HUANG Shuo1,LI Mingzhen1,ZHANG Hongbo1,HE Qiyong1,JIANG Shan3,JIN Qi2*(1.Department of Surgery,The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi 154002,China;2.Department of Internal Medicine,The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi154002,China;3.College of MBA,Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi154003,China)

Objective:To investigate the protection of Danshen on tubular cell induced by renal ischemia reperfusion injury in rats.Methods:Male,Wistar rats were randomly divided into 4 groups:sham surgery group,model group(renal ischemia reperfusion injury group),medication group 1(drug given before renal ischemia reperfusion 24 hours)and medication group 2(drug given after renal ischemia reperfusion 12 hours).Renal ischemia reperfusion injury models were set up by clamping both sides of renal arteries 22 minutes.The level of serum creatimine and blood urea nitrogen was measured by colorimetry,protein expressions of renal cysteinyl aspartate-specific protease(caspase-3)were detected by western blotting.Cell apoptosis was confirmed by Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End labeling(TUNEL)analysis.Results:Comparing the sham group and the model group,the kidney function decreases sharply(P<0.05);protein expressions of caspase-3 increases remarkably(P<0.05);lots of tubular cell apoptosis(P<0.05).Using Danshen 24 huors before reperfusion was found remarkably improve renal function(P<0.05),decrease the expressions of caspase-3(P<0.05)and cell apoptosis(P<0.05).And using this medication 12 hours after reperfusion,administrating Danshen did not show us any effect on renal function,cell apoptosis,and the expressions of caspase-3(P>0.05).Conclusion:Before renal ischemia reperfusion,using Danshen for rats,that has the function of decompressing the cell apoptosis induced by renal ischemia reperfusion injury and protection the renal function.

Ischemia reperfusion injury;Kidney;Apoptosis腎臟缺血再灌注引起的腎臟損害，是一個臨床上的常見病[1]， 在休克和腎臟移植患者中，是急性腎臟衰竭的最常見原因。過去40年中，休克患者的急性腎臟壞死率一直接近50%，無明顯改變[2]。對于腎臟缺血再灌注損傷的治療，仍為支持療法，因此，改進治療策略，預(yù)防腎臟缺血再灌注損傷，受到廣大學(xué)者的關(guān)注[3]。

R-332

A

1674-4721（2010）11（c）-012－03

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項目（11513110）。*

2010-10-08）