銀杏達(dá)莫在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

崔 磊 矯春曉 李敬田 黃奇迅*

銀杏達(dá)莫（Geinkgo Leaf Extract and Dipyridamole Injection，GLED）是銀杏黃酮（Geinkgo Leaf Extract）、雙嘧達(dá)莫（Dipyridamole）等的復(fù)方制劑，具有擴(kuò)張心腦血管、抑制血小板聚集及釋放等功能，在臨床上被廣泛應(yīng)用于各種缺血缺氧性疾病。但其具體作用機(jī)制至今仍未完全明確。本實(shí)驗(yàn)以H2O2造成動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，進(jìn)行原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）及家兔血管內(nèi)皮損傷試驗(yàn)，觀察銀杏達(dá)莫在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中的保護(hù)作用，初步探討其作用機(jī)制，為銀杏達(dá)莫更好的應(yīng)用于臨床各種缺血性疾病提供一定的理論基礎(chǔ)[1-3]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

銀杏達(dá)莫注射液（貴州益佰制藥股份有限公司），實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)液按遞倍稀釋法稀釋至所需濃度。MTT、胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；微量MDA試劑盒，SOD試劑盒（南京建成公司）；PRMI1640培養(yǎng)基（濰坊醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；H2O2（30%）；青霉素，鏈霉素（魯抗醫(yī)藥）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)組織及動(dòng)物選擇

足月新生兒臍帶（煙臺(tái)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院產(chǎn)科）；家兔（濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

①正常對(duì)照組；②H2O2（終濃度150μmol/L）損傷組；③GLED干預(yù)組（400、200、100、50μmol/L）。

1.3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

取足月新生兒臍帶（20～30cm，4h內(nèi)），采用王皓等[4]方法（培養(yǎng)基為PRMI1640培養(yǎng)基）進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。

1.3.3 銀杏達(dá)莫在HUVECs氧化損傷中的保護(hù)作用

HUVECs傳2～3代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，培養(yǎng)板接種，37℃，5%CO2孵育24h后，按實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)分10組：損傷組及干預(yù)組加入終濃度為150μmol/L H2O2進(jìn)行損傷0.5h后，正常組及損傷組加入含20%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基；干預(yù)組分別加入各濃度銀杏達(dá)莫。培養(yǎng)4h后，收集細(xì)胞或培養(yǎng)液進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MTT比色法測(cè)定HUVECs增殖率

細(xì)胞接種于培養(yǎng)板相關(guān)培養(yǎng)后，加入MTT（終濃度0.5mg/L），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h后，2500轉(zhuǎn)/min、4℃ 10min離心后吸棄上清液，加入二甲基亞砜100μL/孔，10min后于酶標(biāo)儀上測(cè)570 nm處吸光度值（OD570）。計(jì)算細(xì)胞損傷增殖率，并依次應(yīng)用OriginPro 軟件分析EC50。

2.2 銀杏達(dá)莫對(duì)動(dòng)物動(dòng)脈內(nèi)皮氧化損傷的保護(hù)作用

2.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚5-9]

氧化損傷模型：參照實(shí)驗(yàn)家兔血容量由耳緣靜脈注射H2O2（終濃度達(dá)150umol/L）；損傷保護(hù)模型：氧化損傷半小時(shí)后參照家兔血容量由耳緣靜脈注射銀杏達(dá)莫（終濃度達(dá)400μmol/L）。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

隨即所選15只家兔分為3組，每組各5只，統(tǒng)一飼料、飲水室溫飼養(yǎng)1周后分組。①正常對(duì)照組：不予以任何處理，繼續(xù)以相同飼料、飲水室溫飼養(yǎng)。②氧化損傷組。③ GLED保護(hù)組，處理參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头椒?。每周日處理一次，統(tǒng)一飼料、飲水室溫飼養(yǎng)，連續(xù)4周后取家兔腹主動(dòng)脈HE染色，鏡下觀察動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。

2.1.3 銀杏達(dá)莫對(duì)家兔動(dòng)脈氧化損傷的保護(hù)作用

腹腔麻醉家兔（戊巴比妥鈉30mg/kg體質(zhì)量），快速剪開腹正中皮膚及肌肉，分離腹主動(dòng)脈，洗凈處理后常規(guī)石蠟包埋、切片（4μm厚），常規(guī)H-E染色。

表1 銀杏達(dá)莫在HUVECs氧化損傷中的保護(hù)增殖率

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖率

對(duì)H2O2造成的HUVECs氧化損傷銀杏達(dá)莫有顯著的保護(hù)作用，可提高損傷細(xì)胞的增殖率，見表1及圖1。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)率

3.2 H-E染色觀察銀杏達(dá)莫在家兔動(dòng)脈內(nèi)皮氧化損傷中的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較高濃度銀杏達(dá)莫對(duì)H2O2造成的動(dòng)脈內(nèi)皮損傷有比較顯著的保護(hù)作用。H-E染色結(jié)果分別為：①正常對(duì)照組腹主動(dòng)脈壁層次清晰，內(nèi)膜薄，中層平滑肌層無(wú)萎縮、厚度均勻，外層為疏松結(jié)締組織，見圖2-1。②損傷模型組腹主動(dòng)脈壁層次欠清，可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜下炎細(xì)胞浸潤(rùn)。中層平滑肌層明顯萎縮，外層為疏松結(jié)締組織缺如或稀少，見圖2-2。③ GLED保護(hù)組動(dòng)脈各層與正常對(duì)照無(wú)明顯區(qū)別，未見炎細(xì)胞，分別見圖2-3、圖2-4。

4 討 論

H2O2產(chǎn)生的自由基（·OH）在機(jī)體內(nèi)性質(zhì)極為活潑，具有強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化作用，病理狀態(tài)下，過氧化物產(chǎn)生過多或抗氧化酶類活性降低，則可引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞多種成分（膜磷脂、蛋白、核酸），以致使細(xì)胞死亡。本研究以H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷后，細(xì)胞病死率升高，增值率下降，細(xì)胞清除自由基的能力下降；

圖2 H-E染色觀察銀杏達(dá)莫在家兔動(dòng)脈內(nèi)皮氧化損傷中的保護(hù)作用

自由基造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是多種缺血性疾病發(fā)生進(jìn)展的關(guān)鍵因子，內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的第一步和決定性因素。所以，清除自由基減少內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是防治動(dòng)脈粥樣硬化的必要途徑[10,11]。

實(shí)驗(yàn)中各濃度的銀杏達(dá)莫，對(duì)H2O2造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷均能起到一定的保護(hù)作用，并且有一定的濃度依賴性。說(shuō)明銀杏達(dá)莫在缺血性疾病的防治中的作用可能與清除自由基有關(guān)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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