不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響

李潔 彭麗娜 余小燕 陳莉

1西北師范大學(xué)體育學(xué)院（蘭州 730070） 2廊坊師范學(xué)院3青海省體育科學(xué)研究所 4甘肅省蘭州市第八十二中學(xué)

低氧訓(xùn)練是利用“缺氧”刺激使機(jī)體各系統(tǒng)產(chǎn)生抗缺氧的生理性適應(yīng)，從而提高機(jī)體運(yùn)輸和利用氧的能力，最終達(dá)到提高有氧代謝能力的目的［1］。低氧環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響是多方面的。不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)血液運(yùn)氧能力、組織毛細(xì)血管密度及有氧代謝酶活性的影響已見報(bào)道［2-5］。但有關(guān)不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)組織線粒體呼吸鏈功能影響的研究少見報(bào)道。腦作為神經(jīng)系統(tǒng)的中樞，在機(jī)體正常生理活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的調(diào)節(jié)作用。另外，腦組織幾乎不能進(jìn)行糖無(wú)氧代謝，因此其線粒體氧化磷酸化的功能在腦能量合成代謝中的作用尤為重要。鑒此，本研究通過(guò)比較四種低氧訓(xùn)練模式下大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ活性，探討不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)腦線粒體呼吸鏈功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性健康2月齡W istar大鼠50只（由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重130g左右。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，室溫23±2℃左右，相對(duì)濕度50±5%，自然采光。飼養(yǎng)室、用具等定期（每周一次）用紫外燈消毒滅菌。

1.2 低壓氧艙

本實(shí)驗(yàn)所用的模擬低氧環(huán)境設(shè)備是自制的低壓氧艙，采用降低環(huán)境大氣壓的辦法形成低壓低氧條件。主要用有機(jī)玻璃制成一封閉室（艙），安裝通入室內(nèi)的抽氣閥和進(jìn)氣閥，再與真空泵連接，啟動(dòng)真空泵，不斷抽出室內(nèi)氣體，造成低氣壓。操縱氣閥，調(diào)節(jié)抽氣量和進(jìn)氣量的比例，造成艙內(nèi)模擬高原高度3500m的低氣壓低氧環(huán)境。艙內(nèi)壓力用標(biāo)準(zhǔn)海拔表校正［6］。

1.3 適應(yīng)性訓(xùn)練及動(dòng)物篩選

（1）環(huán)境適應(yīng)：大鼠購(gòu)入后在動(dòng)物房飼養(yǎng)2天，使大鼠適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境。（2）跑臺(tái)適應(yīng)：所有大鼠在常氧（海拔1500m，大氣壓為632mmHg，氧濃度為 17.4%）條件下進(jìn)行1次/天、共2天的水平跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，每次運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從12m/min開始遞增到18m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間15min。使大鼠熟悉跑臺(tái)。（3）強(qiáng)度適應(yīng)性訓(xùn)練：大鼠適應(yīng)跑臺(tái)后進(jìn)行1次/天、共1周的強(qiáng)度適應(yīng)性訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從20m/min開始，每天遞增 3m/min，最終達(dá)到 35m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間15min。使大鼠逐漸適應(yīng)正式耐力訓(xùn)練的強(qiáng)度。（4）低氧適應(yīng)：分為居住性適應(yīng)和運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)，首先，所有大鼠進(jìn)行2天低氧艙內(nèi)居住適應(yīng)，模擬海拔高度從2500m增至3500m（大氣壓為493mmHg，氧濃度13.6%），每天適應(yīng)2h。隨后進(jìn)行4天低氧遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)適應(yīng)，模擬海拔高度3500m，跑臺(tái)速度由20m/min遞增到30m/min，訓(xùn)練時(shí)間由 30min遞增到 60min。（5）動(dòng)物篩選：根據(jù)體重、低氧適應(yīng)和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)情況，淘汰體重過(guò)重或過(guò)輕、低氧適應(yīng)性較差和不適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠，保留40只大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物分組

篩選出的40只大鼠隨機(jī)分為5組（n=8）：常氧訓(xùn)練組（living low-training low，LoLo）、高住高練組（living high-training high，HiHi）、高住低訓(xùn)組（living high-training low，HiLo）、低住高練組（living low-training high，LoHi）和高住高練低訓(xùn)組（living high-exercise high-training low，HiHiLo）。稱量各組大鼠體重。LoLo組在常氧環(huán)境進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓(xùn)練日24h生活在常氧環(huán)境。HiHi組在低氧（模擬海拔3500m高原，氧濃度為13.6%）環(huán)境進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間以外均生活在低氧環(huán)境中。非訓(xùn)練日24h生活在低氧環(huán)境。HiLo組在低氧環(huán)境生活12h/d，在常氧環(huán)境進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練后生活在常氧環(huán)境。非訓(xùn)練日12h生活在低氧環(huán)境，12h生活在常氧環(huán)境。LoHi組在低氧環(huán)境進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓(xùn)練日24h生活在常氧環(huán)境。HiHiLo組低氧環(huán)境生活12h/d，常氧環(huán)境進(jìn)行訓(xùn)練，另外，訓(xùn)練日隔天增加一次低氧環(huán)境訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓(xùn)練日12h生活在低氧環(huán)境，12h生活在常氧環(huán)境。

1.5 訓(xùn)練安排

參見文獻(xiàn)［7］。訓(xùn)練組大鼠采用水平動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行耐力訓(xùn)練，訓(xùn)練強(qiáng)度常氧下第1周25m/min，第 2～4周30m/min，第 5周 35m/min，低氧（氧濃度為13.6%）下第 1周 20m/min，第 2～4周 25m/min，第 5周 30m/min；持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間第 1周 30min/d，第 2周 40min/d，第 3周50min/d，第4～5周60min/d；每周訓(xùn)練6天。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中均使用機(jī)械刺激，未使用電刺激。

1.6 取樣及線粒體制備

各組大鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束，均在常氧環(huán)境恢復(fù)生活72h，稱體重后，進(jìn)行速度為35m/min水平跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)。力竭標(biāo)準(zhǔn)為［8］：大鼠跟不上預(yù)定跑臺(tái)速度，腹部與跑道面接觸，后肢蹬地?zé)o力，臀部壓在跑臺(tái)后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30s，毛刷刺激驅(qū)趕無(wú)效，視為力竭。力竭后即刻斷頭處死大鼠，迅速取出腦組織，置于冷生理鹽水中洗凈，濾紙吸干表面水分，置于液氮中冷凍，－20℃低溫保存待用。腦組織勻漿液及線粒體制備參照文獻(xiàn)［9］。

1.7 測(cè)試指標(biāo)及方法

（1）線粒體呼吸鏈酶活性：參照Vyatlina的方法用分光光度法測(cè)定線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性［10］。將10～20μg線粒體蛋白加入到終體積為2m l的緩沖液中，以蒸餾水作空白管，校正光密度到0點(diǎn)，測(cè)定一定波長(zhǎng)處3min光吸收值的變化。酶活性單位為μmol·mgpro-1·min-1。

（2）消光系數(shù)的測(cè)定：分別配制NADH（nicotinamide adenine dinuclectide-reduced，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、DCPIP（2，6-dichlorophenolindophenol，2，6-二氯酚靛酚）和 cytochrome c（細(xì)胞色素C）的濃度梯度，在一定波長(zhǎng)處，用10mm光徑的比色杯比色，記錄消光值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的K值為各物質(zhì)的消光系數(shù)。NADH 的消光系數(shù) ε=5.022mM-1·cm-1，DCPIP 的消光 系 數(shù) ε=16.625mM-1·cm-1，cytochrome c 的 消 光 系 數(shù)ε=7.038mM-1·cm-1。

（3）蛋白濃度測(cè)定：以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.8 試劑與藥品

2，3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1，4-benzoquinone（DB）、NADH、rotenone、cytochrome c、antimycin 為 Sigma 公 司產(chǎn)品，2，6-dichlorophenolindophenol（DCPIP）為 Fluka公司產(chǎn)品，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.9 主要儀器

YQ-3電動(dòng)勻漿器（江蘇金壇市儀表儀器廠）、UV 754N紫外分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），DSPT-202型動(dòng)物跑臺(tái)（中國(guó)杭州段氏制作），UNIVERSAL 32R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)），低壓氧艙（自制），海拔表（德國(guó)）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用SPSS13.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA單因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化

正式實(shí)驗(yàn)前，與常氧訓(xùn)練組比較，4種不同低氧訓(xùn)練模式組大鼠體重均無(wú)顯著性差異（P=0.524，P=0.058，P=0.740，P=0.136）。5周實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后，5組大鼠體重較實(shí)驗(yàn)前均有所增加，與常氧訓(xùn)練組比較，各組均無(wú)顯著性差異（P=0.198，P=0.840，P=0.219，P=0.707）。見表1。

表1 各組大鼠體重比較（n=8）

2.2 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間

5周不同低氧模式訓(xùn)練后，與LoLo組相比，HiHi組、HiLo組和LoHi組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間均無(wú)顯著差異（P=0.078，P=0.595，P=0.294），HiHiLo 組力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P=0.040），延長(zhǎng)19.85%。見表2。

表2 各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間比較（n=8）

2.3 腦組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ~Ⅲ活性

由表3可見，與LoLo組相比，其它各組大鼠腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ活性均無(wú)顯著變化；LoHi組CⅡ活性顯著下降（P=0.016），降低76.199%，其余各組均無(wú)顯著變化。HiHi組、HiLo組和LoHi組CⅢ活性均顯著下降（P=0.001，P=0.002，P=0.000）， 分 別 降 低 71.496% 、65.240%和 87.838%；HiHiLo組顯著上升（P=0.000），提高170.145%。

表3 各組大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性比較（n=10） 活性單位：μmol·mgpro-1·min-1

3 討論

有研究報(bào)道［11］，常氧運(yùn)動(dòng)組、髙住高練組、高住低訓(xùn)組和低住高練組大鼠實(shí)驗(yàn)前體重均無(wú)顯著性差異，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠體重隨著周齡的增加而增長(zhǎng)，其中髙住高練組體重增長(zhǎng)最慢，第4周末與常氧運(yùn)動(dòng)組大鼠相比具有顯著性差異（P<0.05），其余各組體重增長(zhǎng)的規(guī)律比較一致，且無(wú)顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)中，5周不同模式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，各組大鼠體重與訓(xùn)練前相比均有所增加。與常氧訓(xùn)練組相比，各組均無(wú)顯著性差異。不同低氧訓(xùn)練模式下大鼠體重的變化同常氧訓(xùn)練模式一致，說(shuō)明低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)與常氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響無(wú)差異。以上髙住高練組研究結(jié)果的不一致可能與運(yùn)動(dòng)量和低氧程度不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與常氧訓(xùn)練模式相比，大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間，HiHi組、HiLo組、LoHi組均無(wú)顯著性變化，HiHiLo組顯著延長(zhǎng)（P<0.05），延長(zhǎng) 19.85%，表明HiHiLo模式更有利于延長(zhǎng)大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間。

已有研究表明，大鼠遞增負(fù)荷訓(xùn)練7周，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻，與一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ、CⅡ和CⅢ活性均無(wú)顯著性變化［9］。HiLo（高住低練）4周組大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ、CⅡ和CⅣ活性與常氧安靜對(duì)照組相比顯著升高（P<0.05或P<0.01），CⅢ活性無(wú)明顯變化［12］。以上研究說(shuō)明低氧訓(xùn)練可影響機(jī)體組織線粒體呼吸鏈酶活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常氧訓(xùn)練組比較，HiHi組和HiLo組腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ和CⅡ均無(wú)顯著變化，CⅢ活性均顯著性下降（P<0.01），分別下降71.496%和65.240%。LoHi組CⅠ活性無(wú)顯著變化，CⅡ和CⅢ活性均顯著下降（P<0.05，P<0.01），分別下降 76.199%和87.838%。由于CⅢ是電子傳遞鏈的限速步驟［13］，其活性降低必將影響呼吸鏈的功能，進(jìn)而影響ATP的合成能力，因此，HiHi、HiLo和 LoHi在改善腦線粒體呼吸鏈功能方面與常氧訓(xùn)練比未見優(yōu)勢(shì)。HiHiLo組CⅠ和CⅡ均無(wú)顯著變化，CⅢ活性均顯著升高（P<0.01），提高170.145%，升高幅度較大。這提示HiHiLo模式較常氧訓(xùn)練具有顯著提高腦線粒體電子傳遞鏈功能的效果。已有研究表明HiHiLo訓(xùn)練手段對(duì)血象指標(biāo)和有氧運(yùn)動(dòng)能力的影響效果好于LoHi，尤其在賽前大負(fù)荷訓(xùn)練期間應(yīng)采用 HiHiLo 模式［14］。

4 總結(jié)

就本研究建立的模擬海拔3500m高度的四種低氧訓(xùn)練模式來(lái)說(shuō)，髙住高練低訓(xùn)比常氧訓(xùn)練具有顯著提高線粒體電子傳遞鏈功能的效果，髙住高練、高住低訓(xùn)和低住高練在改善線粒體呼吸鏈功能方面與常氧訓(xùn)練比未見優(yōu)勢(shì)。

［1］高炳宏.模擬低氧訓(xùn)練的新方法與新進(jìn)展.體育科研，2005，26（2）：44-49.

［2］路瑛麗，馮連世，趙鵬，等.不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)大鼠血液運(yùn)氧能力的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（1）：68-70.

［3］高炳宏，步振威，王道，等.LoLo、HiLo、LoHi和 HiHiLo 訓(xùn)練過(guò)程中血象指標(biāo)變化規(guī)律的比較研究.體育科學(xué)，2005，25（10）：32-36.

［4］趙鵬，路瑛麗，馮連世，等.低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌VEGF mRNA表達(dá)及毛細(xì)血管密度的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（2）：131-135.

［5］路瑛麗，趙鵬，馮連世，等.不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)大鼠腓腸肌有氧代謝酶活性的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（2）：136-138.

［6］翁慶章，鐘伯光.高原訓(xùn)練的理論與實(shí)踐.北京：人民體育出版社，2002.281-282.

［7］李潔，張耀斌，邢良美.不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)大鼠肝臟及腎臟組織內(nèi)自由基代謝的影響.體育科學(xué)，2008，28（5）：56-61轉(zhuǎn)68.

［8］田野，高鐵群.大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型的建立.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，18（4）：49-53.

［9］李潔，王玉俠，張耀斌，等.補(bǔ)充輔酶Q10及遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌和腦線粒體電子傳遞鏈酶復(fù)合體活性的影響.體育科學(xué)，2008，28（1）：43-48，65.

［10］Vyatlina G，Bhatia V，Gerstner A，et al.Impaired mitochondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development.Biochimica et Biophysica Acta，2004，（1689）：162-173.

［11］徐國(guó)琴，林文弢，翁錫全，等.不同低氧預(yù)適應(yīng)方式對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響.體育科學(xué)，2006，26（11）：84-87.

［12］王耀光，齊敦禹，李興海，等.高住低訓(xùn)對(duì)大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的影響.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2008，27（4）：484-485.

［13］Moreno-Sanchez R，Espinosa-Garcia MT，Raja JC.Control of respiration and ATP hydrolysis in uncoupled mitochondria.In:Lemasters JJ，editor.Integration ofmitochondrial function.New York:Plenum，1988，297-304.

［14］劉海平，胡揚(yáng)，田野，等.HiHiLo與LoHi兩種低氧訓(xùn)練效果的比較研究.體育科學(xué)，2006，26（4）：58-61，75.