補充香菇多糖對長期大負荷運動小鼠免疫調節(jié)作用

史亞麗 蔡德華 王曉潔 杜蓉

1魯東大學體育學院（煙臺 264025） 2魯東大學食用菌工程研究中心 3魯東大學生命科學院

香菇（Lentinus edodes）含有多種有效藥用組分，尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）。它是一種重要的生物反應調節(jié)劑，通過刺激免疫細胞成熟、分化和增殖，改善宿主機體平衡，達到恢復和提高宿主細胞對淋巴因子、激素和其它生理活性因子的反應性[1，2]。LNT對提高運動機體免疫力方面的研究尚未見報道。本實驗對長期進行大負荷運動小鼠灌胃LNT，觀察補充LNT對運動小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力、血清抗體相對含量及體外抗體形成細胞數(shù)量（體液免疫）的影響，探討補充LNT對長期大負荷運動小鼠的免疫調節(jié)作用，為其作為運動營養(yǎng)補品的研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明種小鼠120只，雄性，18～22g，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號:SYXK（魯）20030020。一級白色豚鼠，體重 300～400g，山東中醫(yī)藥大學提供，動物合格證號:SCXK（魯）20050015。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境23℃±2℃，濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律。

1.2 動物分組與處理

120只小鼠適應性喂養(yǎng)3天后，隨機分為安靜對照組（C）、運動組（T）、鹽水 +運動組（S+T）、高劑量 LNT+運動組（HL+T）、中劑量 LNT+運動組（ML+T）、低劑量LNT+運動組（LL+T），每組20只。實驗后期死亡14只，T組死亡 3只，S+T組 4只，HL+T組 2只，ML+T組 2只，LL+T組3只。灌胃及訓練結束后將每組小鼠隨機分為a、b兩小組，a小組進行巨噬細胞吞噬功能的測定，b小組用作血清凝集效價（抗體相對含量）測定及體外抗體形成細胞數(shù)量測定。

1.2.1 運動條件

塑料游泳池，100cm×60cm×50cm，水深40cm，超過小鼠體長2倍，水溫32～34℃。

1.2.2 訓練方案

C組:不進行運動訓練，只進行正常的生理活動。T、S+T、HL+T、ML+T、LL+T各組小鼠進行 5%負重游泳訓練，持續(xù)4周，6次/周，周日休息。第一周從20min開始負重游泳，以后每日增加5min直至45min/日，運動時間不足45min就發(fā)生力竭的小鼠迅速撈起，擦干身體休息5min后再放入水中繼續(xù)游泳，訓練時間累計須達到45min/次。訓練結束后，迅速用電吹風吹干身體。

1.3 補充方法

1.3.1 香菇多糖的提取

香菇由魯東大學食用菌工程研究中心提供。子實體50℃烘干、粉碎、稱重、熱水浸提、過濾、濾液醇沉得多糖[3]。多糖含量測定方法參照文獻[3]。

1.3.2 補充方法

采用灌胃法，HL+T組每日劑量400mg/kg，ML+T組200mg/kg，LL+T組 100mg/kg。用生理 鹽水 配制 成400mg/10ml、200mg/10ml、100mg/10ml的 LNT 鹽水溶液，每日0.2ml劑量灌胃，S+T組灌胃等體積生理鹽水。1次/d，時間為4周。

1.4 指標測定

1.4.1 巨噬細胞吞噬功能的測定

可溶性淀粉6g加入肉湯培養(yǎng)液100ml中，混勻，煮沸滅菌備用。a小組每只小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉，1ml/只，當日停止訓練，繼續(xù)灌胃。3日后于小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.2ml，輕柔腹部，注射后30min于小鼠腹腔注射生理鹽水1ml，輕柔腹部數(shù)次。采集腹水:取小鼠自然站立位。在恥骨前緣，腹中線兩側剪毛、消毒，浸潤麻醉，緊繃穿刺部位皮膚，作垂直穿刺。用注射器慢慢回抽，滴1滴于潔凈載玻片上，推成薄片，晾干后甲醇固定4～5min。滴加瑞士－吉姆薩染液，染色3min，流水沖洗，自然晾干，油鏡下觀察。隨機計數(shù)100個巨噬細胞，記錄并計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)=100個巨噬細胞所吞噬的雞紅細胞總數(shù)／100；吞噬率=100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)／100×100%[4]。

1.4.2 血清凝集效價（抗體相對含量）和體外抗體形成細胞（PFC）測定（脾臟溶血空斑形成）

于灌胃及訓練結束前第4天，b小組每只小鼠腹腔注射5%SRBC懸液0.2ml致敏，以生成抗體形成細胞及產生抗體，繼續(xù)灌胃及訓練。

（1）血清凝集效價（抗體相對含量）測定:灌胃及訓練結束后，將b小組小鼠頭朝下，斷頸采血，血液37℃水浴放置2h，轉入冰箱放置2h，分離血清，進行抗體凝集反應[4]，測定血清凝集效價。

（2）體外抗體形成細胞（PFC）測定:按文獻[5]制備豚鼠血清。將b小組小鼠脾臟用生理鹽水制成1×107/ml脾細胞懸液，取0.1ml脾細胞懸液和5%SRBC懸液，迅速保溫于47℃水浴中的3.5ml濃度為0.7%瓊脂糖管內，搖勻后立即將混合物傾入鋪有底層瓊脂糖凝膠的平皿內，輕搖使其鋪開，待瓊脂凝固后，37℃孵育1h。每皿加入 1∶10稀釋的豚鼠血清2ml為補體，使其均勻覆蓋表面。37℃孵育30min，室溫放置1h，4℃冰箱過夜，次日傾去補體，低倍鏡下觀察，空斑中央為淋巴細胞，周圍為透明區(qū)。計數(shù)每皿空斑數(shù)，單位為個/106脾細胞[4]。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力

4周大負荷的運動訓練后，T組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)較C組明顯降低。中、高劑量LNT+運動組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率顯著高于鹽水+運動組和低劑量LNT+運動組，中劑量LNT+運動組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)顯著高于鹽水+運動組和低劑量LNT+運動組。

表1 各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力比較

2.2 小鼠血清凝集效價、體外抗體形成細胞數(shù)量

4周大負荷的運動訓練后，T組血清凝集效價、體外抗體形成細胞數(shù)較C組明顯降低。低、中、高劑量LNT+運動組小鼠血清凝集效價均顯著高于鹽水+運動組，中劑量LNT+運動組小鼠血清凝集效價顯著高于低劑量LNT+運動組；中劑量LNT+運動組小鼠體外抗體形成細胞數(shù)顯著高于鹽水+運動組和低劑量LNT+運動組。

表2 各組小鼠血清凝集效價、體外抗體形成細胞數(shù)量比較

3 討論

運動訓練對免疫系統(tǒng)及其功能的影響可歸納為兩方面:急性短時中等強度運動激活免疫系統(tǒng)并提高免疫功能，長時間耐力運動或長期強化性訓練則抑制免疫功能[6]。力竭運動可抑制腹膜巨噬細胞MHCⅡ的表達，進而影響巨噬細胞的抗原呈遞作用，抑制巨噬細胞的功能[7，8]。大強度運動后B細胞合成和分泌免疫球蛋白的功能出現(xiàn)明顯改變，以75%VO2max強度運動1h，合成與分泌IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白的細胞功能在運動過程中和運動結束后明顯降低[6]。本實驗結果顯示，運動組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)、血清凝集效價、體外抗體形成細胞數(shù)量均顯著低于對照組，表明長期大負荷運動小鼠處于運動性免疫抑制狀態(tài)。

LNT是一種免疫激活劑，能激活巨噬細胞和淋巴細胞，提高巨噬細胞的趨化性和淋巴細胞對Yac-1細胞和P-815細胞的毒性反應水平[9]。香菇是誘生α-干擾素較明顯的一種真菌，LNT能活化CD4+淋巴細胞，促使CD4+增殖和IL-2R表達[10]。LNT可活化T細胞，并對免疫巨噬細胞起誘導和增強作用，使免疫狀態(tài)由低下恢復到接近于正常。本研究結果顯示，補充中、高劑量LNT均可使長期大負荷運動小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬率明顯提高，中劑量LNT可使長期大負荷運動小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)升高且效果明顯好于低劑量LNT。低、中、高劑量LNT均可使長期大負荷運動小鼠血清凝集效價明顯提高，中劑量LNT效果明顯好于低劑量LNT，中劑量LNT可明顯提高長期大負荷運動小鼠體外抗體形成細胞數(shù)且其效果明顯好于低劑量LNT。

綜上，4周大負荷運動可以導致小鼠運動性免疫抑制。補充LNT可使長期大負荷運動小鼠非特異性及特異性免疫功能得到改善，其中，中劑量LNT補充效果明顯。

[1]芳積年，王順春.香菇多糖的研究進展.中國藥學雜志，1997，3（6）:332-334.

[2]劉棟，錢建亞，卜敏.香菇多糖抗腫瘤作用研究現(xiàn)狀.中國食用菌，2002，22（2）:6-7.

[3]張惟杰.復合糖生化技術.上海:上?？茖W技術出版社，1987.13-15.

[4]司傳平.醫(yī)學免疫學實驗.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.15-17，71-72，74-76.

[5]吳端生，張建.現(xiàn)代實驗動物學技術.北京:化學工業(yè)出版社，2007.285-286.

[6]張愛芳.實用運動生物化學.北京:北京體育大學出版社，2005.378.

[7]Ceddia MA，Woods JA.Exercise suppresses macrophage antigen presentation.J Appl Physiol，1999，87（6）:2253-2258.

[8]Ceddia MA，Voss EW Jr，Woods JA.Intracelluar mechanisms responsible for exercise-induced suppression of macrophage antigen presentation.J Appl Physiol，2000，88（2）:804-810.

[9]Kurashige S，Akuzawa Y，Endo F.Effects of Lentinus edodes，Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus’administration on cancer outbreak，and activities of macrophages and lymphocytes in mice treated with a carcinogen，N-butyl-N’-butanolnitrosoamine. Immunopharmacol Immunotoxicol，1997，19（2）:175-183.

[10]萬克青.香菇多糖注射液對慢性活動型肝炎外周血T淋巴細胞亞群和IL-2R表達作用的研究.中國免疫學雜志，1995，11（5）:298-299.