豬瘟細胞活疫苗細胞制備中分散液消化試驗

崔海輝 （浙江育英職業(yè)技術(shù)學院 杭州 310018）

目前使用的豬瘟活疫苗主要是豬瘟兔化弱毒疫苗和豬瘟脾淋苗[1]。豬瘟細胞活疫苗是利用動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)用豬瘟兔化弱毒株接種易感細胞培養(yǎng)，收獲細胞培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成。豬瘟細胞活疫苗和兔源豬瘟活疫苗生產(chǎn)使用的種毒均是我國自己研發(fā)的豬瘟兔化弱毒株(C株)[2]。

豬瘟細胞活疫苗在實際大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中遇到很多難題，而其中在細胞消化過程中分散液的選擇直接影響到細胞接毒后細胞毒收獲液的效價，因此細胞消化過程中一定要選擇正確的分散液[3,4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒 豬瘟兔化弱毒株(C株) 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，通過兔體繼代，采集定型熱反應(yīng)兔的脾臟作毒種(簡稱脾毒)。物品：5ml注射器、6號針頭、250ml或500ml錐型瓶、120目銅沙網(wǎng)漏斗、眼科剪刀鑷子、500ml大燒杯、大三角瓶（500ml或1000ml）、平皿（中號）、玻璃珠（大些的）、四層紗布漏斗、轉(zhuǎn)瓶等。凍干毒：5瓶0.8g/瓶

1.1.2 犢牛睪丸 來源浙江金華

1.1.3 配液 乳漢(歐)液、7.5%碳酸氫鈉溶液；2萬U雙抗溶液(SP)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)、0.25%胰酶溶液、EDTA胰酶(0.02%～0.05%)、0.4%酚紅、血清(NCS)、原代細胞生長液、乳漢液+9%NCS+0.8% sp+0.5%(7.5%碳酸氫鈉)、維持液、乳漢液+2.0%NCS+ 0.8%SP+0.5%(7.5%碳酸氫鈉)、0.25%胰蛋白酶,使用時調(diào)節(jié)pH值到8.0。

1.2 方法

1.2.1 細胞制備 操作：250ml瓶中取出牛睪丸—燒杯中洗一遍—平皿中去外皮—燒杯中洗兩遍—睪丸中間一直線剪開，用小剪刀將組織刮下—移至燒杯中洗兩遍—剪碎后洗一遍—轉(zhuǎn)至三角瓶中加入玻璃珠和適量的0.25%胰蛋白酶(無需過多胰酶)—37℃水浴消化40-50min左右—棄去胰酶，加入少量營養(yǎng)液搖動三角瓶(此過程未用營養(yǎng)液洗去殘留的胰酶)，加入營養(yǎng)液通過四層紗布漏斗分散細胞至轉(zhuǎn)瓶中(一般每付牛睪丸分散兩瓶細胞)—37℃溫室、8.5r/h培養(yǎng)，2～5d細胞生長至+++與++++之間時即可接毒。觀察細胞時應(yīng)盡量減少細胞瓶內(nèi)液體的流動，24h內(nèi)不要觀察細胞。

1.2.2 一接（接毒比例0.3%） 操作：從冷庫中取出預(yù)先冷凍的乳缽，將半化開的脾毒稱取所需重量置于乳缽中研磨、搗碎，研磨后多加乳漢液，繼續(xù)研磨，讓組織中的毒得到充分釋放。將種毒吸離心瓶中，配平、2000r/min 20min離心。將脾毒上清按比例接入細胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 一接一傳（帶毒傳代） 將分散液、PBS溶液放在37℃恒溫水浴箱中預(yù)熱。取細胞形態(tài)良好、分布均勻且長滿單層的細胞瓶，將瓶身用消毒液擦拭、瓶口用消毒酒精棉擦拭后在酒精燈外焰上燒1周，打開瓶塞。將細胞瓶中原有的細胞生長液倒掉，在火焰保護下向瓶內(nèi)倒入適量PBS洗液，轉(zhuǎn)動細胞瓶，使PBS洗液均勻漫過細胞面，洗去細胞面上存留的血清和營養(yǎng)液，然后倒掉PBS洗液。

向細胞瓶中加入適量細胞分散液，水平方向轉(zhuǎn)動細胞瓶，使細胞分散液均勻漫過細胞面，然后水平放置在桌面上，進行下一瓶消化，同時經(jīng)常旋轉(zhuǎn)細胞瓶并密切觀察細胞面的變化，當細胞面上出現(xiàn)肉眼可見毛玻璃樣，或出現(xiàn)針尖大小的縫隙，或因細胞分散液在瓶內(nèi)轉(zhuǎn)動而出現(xiàn)細細的劃痕時，即可倒掉細胞分散液并盡量倒凈，將細胞瓶水平放在臺案上，待細胞面出現(xiàn)較大裂痕時，細胞脫離瓶壁，此時細胞在分散液的作用下仍繼續(xù)消化。經(jīng)漏鐘連接營養(yǎng)液，向瓶內(nèi)加入含9%血清的細胞生長液，將細胞搖下，此時細胞停止消化。

按1:3分散率補足細胞生長液，將細胞生長液充分混勻，根據(jù)分散率均勻地分裝在無菌的細胞培養(yǎng)瓶中，塞好塞子，加紙帽扎緊，搖勻細胞生長液，將細胞培養(yǎng)瓶放在轉(zhuǎn)瓶機上，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速為8.5r/h，置于37℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后鏡檢觀察。

1.2.4 一傳二接（接毒比例不低于0.35%） 操作：從冷庫中取出預(yù)先冷凍的乳缽，將半化開的脾毒稱取所需重量置于乳缽中研磨、搗碎，研磨后多加乳漢液，繼續(xù)研磨，讓組織中的毒得到充分釋放。將種毒吸離心瓶中，配平、2000r/min 20min離心。將脾毒上清按比例接入細胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 二接一收 5d后收獲，將細胞病毒液收于萬瓶中，每轉(zhuǎn)瓶留30ml母液，加維持液后繼續(xù)培養(yǎng)，4天一收，二收、三收…直至細胞脫落或到八收左右棄去。

1.2.6 取樣稀釋檢驗 從收獲的萬瓶中取1ml樣品，分別稀釋5萬倍和10萬倍，且各檢測5只常溫正常且未受過毒兔子，48h開始每6h測溫并記錄兔子體溫，直至96h。

2 結(jié)果（見表1、表2）

表1 傳代過程中細胞消化現(xiàn)象及48h后生長情況記錄表

3 討論

（1）從本試驗細胞傳代過程中如表1可以看出6種分散液消化現(xiàn)象中EDTA胰酶加0.4%酚紅消化速度快，且細胞呈單個，未見團塊；0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(一周前配,剛化)和0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化)消化速度慢，未見片狀脫落現(xiàn)象，加液后都仍有團塊。48h后觀察細胞的生長情況，EDTA胰酶0.05%～0.02%和EDTA胰酶加0.4%酚紅48h長滿均勻致密的單層；0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(一周前配,剛化)細胞瓶上細胞非常稀，棄去；0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化) 48h細胞長滿不到50%，60h長滿70%。

（2）通過半成品檢驗結(jié)果表2得到用EDTA胰酶

0.05%～0.02%消化細胞的病毒收獲液5萬倍稀釋檢測兔子3只定型熱，2只輕熱，10萬倍稀釋檢測2只定型熱，1只輕熱，2只無反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(現(xiàn)配)化細胞的病毒收獲液5萬倍稀釋檢測兔子2只定型熱，1只輕熱，2只無反應(yīng)，10萬倍稀釋檢測2只輕熱，3只無反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(現(xiàn)配)消化細胞的病毒收獲液5萬倍稀釋檢測兔子2只輕熱，3只無反應(yīng)，10萬倍稀釋檢測全被無反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化)消化細胞的病毒收獲液5萬倍和10萬倍稀釋檢測兔子都無反應(yīng)；用EDTA胰酶加0.4%酚紅消化細胞的病毒收獲液5萬倍稀釋檢測兔子4只定型熱，1只輕熱，10萬倍稀釋檢測3只定型熱，2只輕熱。

表2 豬瘟細胞活疫苗半成品檢驗結(jié)果

本試驗中用EDTA胰酶加0.4%酚紅消化細胞的病毒收獲液檢測兔子起溫效果最好，可見細胞消化中分散液對細胞消化的好壞及之后生長起著關(guān)鍵的作用。細胞生長的好壞就直接影響到細胞瓶接毒后細胞毒收獲液的效價，因此細胞消化過程中一定要選擇正確的分散液。

[1] 張延齡,張暉.疫苗學[M].北京:科學出版社,2004,5-8.

[2] 佚名.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[C].中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2000, 45-51.

[3] 胡顯文,肖成祖,李佐虎.細胞工程在生物制藥工業(yè)中的地位[J].生物技術(shù)通訊,2001,12(2):117-119.

[4] 鄂征.組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)[M].北京出版社，1995,76-79.

[5] R.I.費雷什尼編.實用動物細胞培養(yǎng)液技術(shù)[M].-Animal Cell culture,a Proactical approach//潘孝珍等譯.北京:世界圖書出版公司，1996.