養(yǎng)殖黑鯛遲緩愛(ài)德華菌的分離鑒定

閆茂倉(cāng) 王雪鵬 丁 雷（浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 溫州 325005 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

遲緩愛(ài)德華菌是革蘭氏陰性、能運(yùn)動(dòng)的短桿菌(直徑1μm，長(zhǎng)2～3μm)，可在NaCL濃度0～40g/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落直徑0.5～1.0mm，菌落圓形，邊緣整齊，灰白色，濕潤(rùn)。4～10℃能夠生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度25～32℃，可在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落為黑色。這一種屬的細(xì)菌主要是從人類(lèi)的糞便、血液、傷口和尿中分離出來(lái)，因?yàn)檫@些細(xì)菌在生物學(xué)上與其他腸桿菌科成員不同，所以在1965年以美國(guó)細(xì)菌學(xué)家愛(ài)德華(1901～1966)的名字重新命名，為遲緩愛(ài)德華菌[1,2]。

遲緩愛(ài)德華菌由Hoshina在1962年首次從鰻鱺中分離到，感染范圍很廣，主要包括大菱鲆，牙鲆，鰻魚(yú)，胭脂魚(yú)，大馬哈魚(yú)，鱒魚(yú)，鯉魚(yú)，羅非魚(yú)，鯰魚(yú)和鱔魚(yú)等，還可以感染兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)等動(dòng)物（包括人），是一種人畜共患病。不僅宿主種類(lèi)不斷增多，地域范圍也不斷擴(kuò)展，除中國(guó)、日本、韓國(guó)、新加坡外，在美國(guó)、德國(guó)、意大利、南非、和挪威等都有相關(guān)病例報(bào)道[1,2]。

2009年夏季，浙江沿海某養(yǎng)殖場(chǎng)的黑鯛成魚(yú)發(fā)生大規(guī)模死亡，作者從中分離了一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)感染證實(shí)了該株菌是引起此次病害的病原菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性、生化特性等，鑒定為遲緩愛(ài)德華菌，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 患出血病癥狀典型的瀕死黑鯛。

1.1.2 培養(yǎng)基 2216E、TSB瓊脂、LB培養(yǎng)基、 SS培養(yǎng)基，購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 取患出血病癥狀典型的瀕死黑鯛，用70%酒精棉球?qū)Σ◆~(yú)體表消毒后，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)腹腔并取出病魚(yú)肝、腎、脾等組織小塊于1ml無(wú)菌離心管中，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗組織塊，劃線(xiàn)接種于2216E、TSB瓊脂、LB培養(yǎng)基、 SS培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24～48h，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)特征觀(guān)察。

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察 取純培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀(guān)察；同時(shí)送到電鏡室做掃描電鏡觀(guān)察。

1.2.3 細(xì)菌生化試驗(yàn) 將菌種接種于TSA平板，28℃培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)菌送至南京進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局用自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化特性測(cè)定。

1.2.4 人工感染試驗(yàn) 感染用魚(yú)210±10g，水溫為23～27℃，試驗(yàn)容器為200L的水槽。先將分離菌接種在TSB固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)36h,用滅菌的生理鹽水洗下菌落，調(diào)整菌液濃度為1×108。10倍系列稀釋共5個(gè)組，每組5尾，每尾腹腔注射100μl，對(duì)照組注射等量生理鹽水，觀(guān)察其感染后的發(fā)病與死亡情況，計(jì)算7d內(nèi)的半數(shù)致死量。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特征

從患病黑鯛分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，此菌在2216E瓊脂平板上生長(zhǎng)緩慢，28℃恒溫培養(yǎng)48h后形成白色細(xì)小菌落，直徑小于0.5mm。在TSB和LB培養(yǎng)基上37 ℃生長(zhǎng)36 h后形成圓形菌落，直徑約0.5mm，微黃色，不透明；在TCBS平板上難以生長(zhǎng)；在SS培養(yǎng)基上形成黑色菌落(見(jiàn)圖1)。

圖1 遲緩愛(ài)德華菌在SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的照片

2.2 形態(tài)特征

分離菌在顯微鏡和電鏡下的照片見(jiàn)圖2，革蘭氏陰性，呈短桿狀。

圖2 遲緩愛(ài)德華菌革蘭氏染色照片（A）和電鏡照片（B）

表1 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 感染試驗(yàn)

在1周內(nèi)，各感染組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，對(duì)照組未出現(xiàn)癥狀，感染后的病魚(yú)體表變黑，吻端發(fā)紅，腹部鼓起有腹水，肛門(mén)紅腫或突出體外。解剖后肝臟有的為白色斑點(diǎn)，脾臟腫大，腎臟暗黑色，易碎成糜狀；腸黏膜充血，腫脹。經(jīng)計(jì)算半數(shù)致死量為8.31×104cfu/mL，表明此菌有很強(qiáng)的致病性。

3 討論

遲緩愛(ài)德華菌由日本學(xué)者于1962年在鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病的鰻魚(yú)中首次分離得到[3]。它可引起多種海、淡水魚(yú)類(lèi)的疾病，并且屬于人畜共患的病原，因此對(duì)該菌的研究具有重要意義。本文從患病黑鯛體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)感染試驗(yàn)證明其為強(qiáng)毒株，在較低的劑量下也可引起黑鯛死亡。利用生化實(shí)驗(yàn)可準(zhǔn)確鑒定為遲緩愛(ài)德華菌，可信度為99%。綜合形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性、生化特性、回歸試驗(yàn)等可鑒定為遲緩愛(ài)德華菌感染。

近幾十年來(lái)，我國(guó)對(duì)遲緩愛(ài)德華菌的研究較多，而有關(guān)遲緩愛(ài)德華菌感染黑鯛的研究比較少。最近有很多遲緩愛(ài)德華菌感染大菱鲆、牙鲆等魚(yú)的報(bào)道[4]，且感染率和死亡率都很高，遲緩愛(ài)德華菌病應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

[1]Mohanty BR, Sahoo PK. Edwardsiellosis in fish: a brief review. J Biosci 2007;32(7):1331–1344.

[2]Xuepeng Wang, Chengping Lu. Mice orally vaccinated with Edwardsiella tarda ghosts are significantly protected against infection.Vaccine 2009, 27 :1571-1578.

[3]Hoshina T. On a new bacterium, Paracolobactrum anguillimortiferum.Bull Jpn Soc Sci Fish 1962,28(2):162–164.

[4]楊春志,王秀華,黃倢.養(yǎng)殖大菱鲆遲緩愛(ài)德華氏菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,17(3):280-284.