紅車軸草異黃酮的生理及藥理作用的研究進展

劉寶劍,魏彥明

(1.河北北方學院教務處,河北張家口075000;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,甘肅蘭州730070)

紅車軸草 (Trifolium pratense L.)為豆科多年生草本植物,又名紅三葉、紅花苜蓿、紅菽草、三葉草等,原產(chǎn)于小亞細亞和西南歐,在歐洲各國及俄羅斯、新西蘭等國海洋性氣侯廣泛栽培.在我國新疆、吉林、云貴高原、湖北鄂西地區(qū)都有野生,適宜在我國亞熱帶高山低溫多雨地區(qū)種植.目前,紅車軸草有許多適應不同環(huán)境的優(yōu)良品種,各地可因地制宜選用,在甘肅岷縣等縣區(qū)已引種多年,且大面積推廣種植.紅車軸草主要含有黃酮類、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類和維生素等多種成分,黃酮類中最主要的是異黃酮,其中以鷹嘴豆芽素A(Biochanin A)、芒柄花素 (Formononetin)、染料木素 (Genistein)、大豆素(Daidzein)等4種為主.研究表明紅車軸草異黃酮具有弱的雌激素樣作用、促進動物生長、抑制癌細胞的生長、改善動脈血管的柔軟性等多種生理功用.

1 抗氧化作用

1.1 清除自由基

自由基及其誘導的氧化反應是導致生物衰老和某些疾病如癌癥、心血管疾病等的重要因素.體內(nèi)過多的氧自由基 (其中·OH化學性質(zhì)最活潑)將作用于蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子,造成細胞結(jié)構(gòu)和功能受損,進而導致物質(zhì)代謝紊亂而引起疾病.清除自由基,主要依賴機體內(nèi)的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng).已有文獻報道中草藥的獨特療效與其作為抗氧化劑,高效清除體內(nèi)自由基作用密切相關.Wei H C等[1]研究認為,染料木素 (Genistein)強烈抑制12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate;TPA)誘導的髓樣白血病細胞株 HL-60細胞中 H2O2的形成,對黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子也具有抑制作用.異黃酮能保護DNA不被氧化破壞,有效消除紫外線引起的8羥基脫氧鳥苷 (8-OHdG)形成和小牛胸腺DNA的損傷[2].異黃酮還能抑制小鼠肝組織勻漿液中脂質(zhì)的過氧化作用,能防止維生素C的氧化[3].一定濃度的紅車軸草異黃酮體外能清除超氧陰離子自由基及羥自由基作用[4].

1.2 抗氧化和對自由基損傷保護作用

Guoetal[5]研究表明,在5 nmol/L生理濃度下,染料木素和大豆黃素分別提高細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽水平約10%和30%.楊麗珍等[6]實驗研究表明,大鼠因內(nèi)分泌改變,有關器官逐漸衰老,清除自由基能力和抗氧化能力下降,并進而出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化作用增加,自由基清除酶類活性下降等變化.經(jīng)紅車軸草異黃酮高、低劑量及大豆異黃酮、倍美力組治療6周后,MDA濃度降低 (P＜0.01或P＜0.05),SOD活性顯著升高 (P＜0.01或P＜0.05),且紅車軸草異黃酮抗氧化作用優(yōu)于倍美力,說明紅車軸草異黃酮通過提高SOD活性,降低MDA濃度,達到提高機體清除氧自由基能力,從而有效延緩衰老.

1.3 對脂質(zhì)過氧化也具有較好的抑制作用

朱宇旌等[7]用紅三葉黃酮粗提物實驗進行抗氧化效果進行比較,添加紅三葉黃酮粗提物對豬油具有良好的抗氧化作用,其中以添加0.2%抗氧化效果最佳,與Vc的抗氧化性相當,比抗氧劑BH T效果好;另外Vc和VE等對紅三葉黃酮粗提物具有明顯的協(xié)同抗氧化作用,效果優(yōu)于單獨添加0.2%黃酮粗提物和Vc、BHT.

對紅車軸草異黃酮抗氧化活性的研究,多集中在其幾種單體的研究,而對紅車軸草總黃酮抗氧化及體外清除自由基的實驗研究鮮見報道,抗氧化效果如何有待進一步研究.

2 對免疫機能的影響

2.1 提高機體免疫力作用

異黃酮能提高動物機體細胞免疫、體液免疫.Wang W,et al.報道[8],大豆黃酮顯著提高刀豆素A(ConA)或脂多糖 (LPS)誘導的脾淋巴細胞增殖反應.大豆黃酮還可促進ConA誘導T淋巴細胞產(chǎn)生白介素-2(IL-2)和白介素-3(IL-3).張榮慶等[9]研究表明,每天給小鼠灌服芒柄花素 (Formononetin)或大豆黃酮 (Daidzein)明顯提高正常小鼠胸腺重量和腹腔巨噬細胞吞噬功能,提高空斑形成細胞的溶血能力和外周血T淋巴細胞百分率;體外試驗表明,芒柄花素或大豆黃素明顯促進植物血凝素 (PHA)誘導的甲基-3H胸腺嘧啶核苷 (methyl-3H TdR)參與的淋巴細胞轉(zhuǎn)化.張榮慶等[10]試驗還表明,妊娠后期攝入大豆黃酮 (Daidzein)可明顯提高母豬對豬瘟疫苗抗原刺激產(chǎn)生的特異性免疫應答反應,血清和初乳中豬瘟抗體和溶血素水平顯著提高,其新生仔豬血清中母源抗體水平亦顯著提高.

2.2 對淋巴細胞活化增殖和周期的影響

紅車軸草異黃酮對淋巴細胞活化增殖有一定影響.林長樂等[11]利用碘化丙啶 (PI)染色流式檢測法發(fā)現(xiàn)Biochanin A也能使增殖的T淋巴細胞停滯于G0/G1期,提示干預 T細胞周期分布可能與上述周期相關蛋白有關.另外,實驗還發(fā)現(xiàn)Biochanin A能夠下調(diào) T淋巴細胞表面標志分子CD3的表達密度,且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性.表明Biochanin A對小鼠T淋巴細胞的活化增殖和周期具有明顯的抑制作用.

林長樂等[12]還研究了鷹嘴豆芽素A抗H IV-1活性及抑制CD4+淋巴細胞早期活化作用,發(fā)現(xiàn)Biochanin A具有抗 H IV-1介導的細胞融合和 H IV-1復制的活性及抑制CD4+淋巴細胞早期活化作用.

3 植物激素樣作用

3.1 提高畜禽生產(chǎn)性能指標

紅車軸草異黃酮具有弱的雌激素樣作用,能提高畜禽的生產(chǎn)性能.王國杰等[13]首次證明日糧中添喂紅三葉草異黃酮植物雌激素能促進公仔雞睪丸和雞冠發(fā)育,使血清睪酮水平顯著提高,在連續(xù)飼喂12 d期間生長速度和飼料利用效率均有所提高,提示異黃酮植物雌激素作為飼料添加劑在促進家禽生長上具有潛在的應用前景.張榮慶等[14]研究表明異黃酮植物雌激素具有弱的雌激素活性,能抑菌,抗菌,提高機體的免疫機能,對畜禽有防病治病的作用.王偉群等[15]研究表明紅三葉草中的芒柄花素具有弱的雌激素活性,引起小公雞血清睪酮水平升高,提高瘦肉率,促進家禽生長的確切生理學機制尚待進一步探討.

3.2 雌激素樣作用

紅車軸草異黃酮具有雌激素樣作用,增加雌性激素及雌性器官重量等指標.Burdette J E等[16]實驗用紅車軸草提取物強飼缺乏雌二醇未孕雌鼠、50日齡卵巢切除鼠21 d.數(shù)據(jù)提示紅車軸草提取物能劑量依賴性增加子宮重量,且兩個高劑量組能剌激陰道細胞分化,但不能刺激乳腺細胞的增殖.在許多組織中既無抗雌激素也無雌激素的累加.這些數(shù)據(jù)表明,紅車軸草提取物 (含15%標準異黃酮)對切除卵巢的斯普拉-道來 (氏)大鼠 (Sp rague-Daw ley Rat)模型實驗,具有弱的雌激素樣作用.

也有學者實驗認為,紅車軸草異黃酮能增加乳腺密度,對雌二醇等沒有影響.A tkinson C等[17]研究紅車軸草異黃酮在乳腺組織中是否有雌激素和抗雌激素樣作用,結(jié)果表明,常規(guī)雌激素替代療法增加乳腺密度,異黃酮補充物則不能增加婦女乳腺密度.此外,對雌二醇、促性腺素、淋巴細胞酪氨酸激酶活性或者絕經(jīng)期癥狀沒有影響.

楊麗珍等[18]實驗,中老年雌性大鼠予以紅車軸草異黃酮胃飼后,與老年模型組相比,雌二醇 (E2)水平有極顯著升高 (P＜0.01),同時促黃體激素 (LH)水平有極顯著下降 (P＜0.01),促卵泡激素(FSH)亦有顯著下降 (P＜0.05),說明紅車軸草異黃酮可改善老年雌性大鼠內(nèi)分泌狀況,阻止下丘腦-垂體-性腺軸機能減退.紅車軸草做為雌激素的替代品在國外被廣泛應用于人的絕經(jīng)期相關疾病的治療,對于療效觀察與研究還有待深入.

4 抗癌細胞作用

4.1 紅車軸草提取物能通過抑制相關酶類等多種途徑而發(fā)揮抗癌作用

Roberts D W等[19]研究表明,鷹嘴豆芽素A和 (或)芒柄花素可通過直接競爭細胞色素 P-4501(CYP1)B1結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗癌作用或間接通過它們的代謝產(chǎn)物大豆黃素和染料木黃酮抑制CYP1 B1而發(fā)揮抗癌作用.Lam AN等[20]研究測定基于紅車軸草異黃酮的抑制鼠巨噬細胞株RAW 264.7和人類單核細胞環(huán)氧化酶活力.異黃酮在1～40μmol/L范圍內(nèi)對RAW 264.7細胞和在10～100μmol/L濃度范圍內(nèi)對人單核細胞具有顯著減少前列腺素E2的合成物和 (或)血栓烷B2(Throm boxane B2)的能力 (P＜0.001 to P＜0.05),表明對環(huán)氧化酶的抑制作用.因此,推測癌癥低發(fā)率人口與高攝入異黃酮的抑制環(huán)氧化酶活性相關的.

4.2 通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用

學者通過不同方法研究了紅車軸草提取物對癌細胞的影響,認為能抑制癌細胞的增殖或誘導癌細胞的凋亡.Fung M C等[21]研究認為鷹嘴豆芽素A不僅能劑量依賴性地抑制髓細胞性白血病WEH I-3B細胞的生長,而且也能誘導W EH I-3B細胞形態(tài)的分化.鄭杰等[22]用不同濃度的紅車軸草提取物處理BGC-823癌細胞,研究對其抑制增殖效應及誘導凋亡作用,實驗結(jié)果表明紅車軸草提取物能抑制胃癌BGC-823細胞增殖,能誘導胃癌細胞凋亡.Cassady J M等[23]實驗通過測定苯并芘在倉鼠胚胎細胞培養(yǎng)物中代謝的影響,來探討鷹嘴豆 (芽)素A抑制致癌物對細胞的作用.結(jié)果表明95%的酒精紅車軸草提取物顯著抑制苯并芘的代謝,使其與DNA結(jié)合水平降低了30%到40%.鷹嘴豆芽素A可以抑制通過碳氫化合物誘導的癌,能有力校正芳族碳氫化物與哺乳動物DNA的結(jié)合以及它們的致癌活性.

尹春萍等[24]利用 TUNEL法、流式細胞術(shù)分析研究表明,紅三葉總異黃酮對MCF27細胞增殖的抑制作用隨藥物質(zhì)量濃度提高和作用時間延長而更加明顯,而在低質(zhì)量濃度時卻出現(xiàn)輕微促細胞增殖現(xiàn)象,紅三葉總異黃酮能誘導MCF27細胞凋亡,阻滯細胞于 G2/M期,降低細胞增殖指數(shù),具有抗腫瘤作用.

4.3 抗乳腺癌作用

M izunuma H等[25]用兩種異黃酮 (鷹嘴豆芽素A、大豆黃素),通過小鼠乳房腫瘤病毒誘導的自發(fā)乳腺癌細胞模型來驗證異黃酮的抗癌作用.認為系統(tǒng)的抗癌效果可能不是通過大豆黃酮或牛尿酚,而是鷹嘴豆芽素A或染料木黃酮,來自于鷹嘴豆芽素A的染料木黃酮在腸道的微生物群的代謝過程中更可能扮演了一個抑制乳腺癌的角色,并認為鷹嘴豆芽素A可能是染料木黃酮的前體.

4.4 防治前列腺癌

Slater M等人[26]研究,在飼喂紅車軸草異黃酮小鼠的前列腺上皮細胞顯示雌激素β受體和上皮細胞鈣粘蛋白顯著的增加,但使轉(zhuǎn)化生長因子β1降低.這些蛋白是被雌激素誘導增殖的、維持組織結(jié)構(gòu)、保持細胞表現(xiàn)型、減少瘤細胞的生成和轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的標記物.表明紅車軸草異黃酮對于前列腺增生能減少潛在的致瘤性轉(zhuǎn)化.Renea A Jarred等[27]研究表明,飲食中添加紅車軸草異黃酮可以通過誘導前列腺癌細胞的凋亡抑制前列腺癌的發(fā)展,可以降低亞洲人的前列腺癌的發(fā)病率.證明通過攝入紅車軸草異黃酮 (160 mg/d)可以誘導前列腺癌細胞凋亡.

5 防治骨質(zhì)疏松

許多學者從不同角度,用不同方法研究紅車軸草異黃酮對骨質(zhì)疏松的影響,結(jié)論基本一致,認為紅車軸草異黃酮對骨質(zhì)疏松有一定的防治作用.李穎等[28]的研究表明紅車軸草異黃酮具有提高雌激素作用,可有效抑制骨吸收,降低骨轉(zhuǎn)化率,加強成骨細胞活性,增加骨密度,對去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用.陳琦等[29]研究結(jié)果表明,紅車軸草異黃酮通過提高血清雌激素水平,增加成骨細胞活性,降低骨高轉(zhuǎn)換率以及減少骨量丟失等多種途徑,能有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥.

Clifton-Bligh PB等[30]研究了紅車軸草提取物對絕經(jīng)期婦女脂質(zhì)和骨代謝的影響,結(jié)果表明,服用紅車軸草異黃酮復合提取物與顯著增加高密度脂蛋白膽固醇、血清載脂蛋白B顯著下降、6月后近端橈骨和臂骨的骨礦物質(zhì)密度顯著升高有著相關性.Wende K等[31]測定紅車軸草不同提取物剌激成骨細胞骨肉瘤HOS58細胞的活性的能力.選擇堿性磷酸酶 (ALP)作為成骨細胞活性的關鍵標記.然而丁醇和甲醇提取物對ALP和細胞蛋白產(chǎn)物是沒有影響的,對與氯仿提取物孵育的酶活有顯著增強.表明紅車軸草異黃酮在激活成骨細胞活性上具有一定作用.A tkinson C.等人[32]實驗研究表明為婦女每天提供紅車軸草異黃酮—鷹嘴豆芽素A 26 m g、芒柄花素16 m g、染料木黃酮1 mg、大豆黃素0.5 mg,一年時間.能減弱骨質(zhì)的流失,可能對婦女的腰椎具有保護作用.

6 對婦女絕經(jīng)期癥狀的影響

在國外,雌激素替代療法對防治婦女絕經(jīng)期癥狀的相關研究很多,特別是從植物中諸如大豆、紅車軸草等提取黃酮類有效成分用來防治婦女更年期疾病的研究比較深入,得出的結(jié)論也不盡相同.

Coon J T等[33]利用元分析研究了紅車軸草異黃酮治療絕經(jīng)期熱潮紅效果,認為紅車軸草異黃酮在治療絕經(jīng)期婦女熱潮紅具有非常顯著的統(tǒng)計學意義,能減少熱潮紅發(fā)生頻率.Krebs E E等人[34]根據(jù)文獻對植物雌激素治療絕經(jīng)期癥狀的功效和耐受性進行評述,認為植物雌激素如大豆食品、大豆提取物,紅車軸草提取物不能改善熱潮紅或其它絕經(jīng)期癥狀.Schult T M等人[35]研究比較兩種補充紅車軸草異黃酮添加物對絕經(jīng)期婦女的脂質(zhì)和骨丟失標記物的影響.與對照組比較,對骨質(zhì)的影響沒有顯著的統(tǒng)計學意義,兩種異黃酮補充物能減少有絕經(jīng)期癥狀婦女甘油三脂的水平,但這種影響在強度上是很小的.

7 對絕經(jīng)婦女認知功能的影響

Howes JB等人[36]研究紅車軸草異黃酮食品添加物對絕經(jīng)后婦女認知功能的影響,說明異黃酮補充物在絕經(jīng)期婦女認知功能上沒有顯出主要短期的作用,但需要進一步臨床試驗確定是否有小的作用或者在異黃酮補充期間對認知其功能的長期作用.

8 對心血管系統(tǒng)的影響

A tkinson C等人[37]研究紅車軸草異黃酮對心血管風險因子的作用,測試總膽汁、LDL膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇、心臟收縮和舒張壓、血纖蛋白原、纖溶酶原激活物抑制劑1(PA I-1)等相關指標.認為飲食中補充紅車軸草衍生物對更年期婦女心血管風險因子有一定的保護作用,證明與49～65歲更年期婦女的載脂蛋白E(Apo E)基因型相互作用有關,但異黃酮單體對血脂的作用不像已被證明的那樣作用明顯.Teede H J等[38]研究表明,對血壓正常的絕經(jīng)期女人食入紅車軸草異黃酮 (Formononetin芒柄花素)可以防治動脈血管硬化和減少總血管阻力,但對血壓沒有影響.Nestel P J等人[39]實驗顯示攝入紅車軸草異黃酮,對改善全身組織動脈血管的順應性來減少冠心病冠狀動脈硬化性心臟病的風險因素,有顯著的效果.

近年來,特別是在“回歸自然”綠色浪潮的推動下,對天然產(chǎn)物有效成分的提取分析與應用研究成為熱點,對優(yōu)良豆科牧草-紅車軸草的相關研究也有逐年增加趨勢.研究表明,紅車軸草在抗氧化、防止骨質(zhì)疏松、抗癌、促進動物生長、提高機體免疫力、治療婦女更年期綜合癥等方面具有作用.研究也發(fā)現(xiàn),在對婦女更年期綜合癥實驗中,得出的結(jié)論也不一致,應就此方向進行更深入研究,以期得到更準確的研究結(jié)果.同時,也應在畜禽飼料方面做一探討,發(fā)揮紅車軸草的藥用及飼用價值,為其深加工提供參考.

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