治療附紅細(xì)胞體病中藥復(fù)方的篩選試驗(yàn)

魏香蒲,崔 平,方素芳,顧小龍

(1.張家口市高新區(qū)農(nóng)委,河北張家口075000;2.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院,河北張家口075000)

豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體寄生于豬紅細(xì)胞表面或血漿中引起的一種人畜共患病[1].近年來,隨著養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展,該病在國內(nèi)部分省區(qū)呈爆發(fā)流行.至今,我國已有14個(gè)省市20多個(gè)縣發(fā)現(xiàn)此病.2006年方素芳等對河北省豬附紅細(xì)胞體病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),河北省部分地區(qū)豬附紅細(xì)胞體感染率達(dá)91.8%[2],給養(yǎng)豬業(yè)造成極大損失.生產(chǎn)中豬受某些應(yīng)激因素 (如寒潮冷、長途運(yùn)輸、饑餓、轉(zhuǎn)欄、爭斗、擁擠等)影響導(dǎo)致抵抗力下降時(shí),則呈現(xiàn)急性感染而出現(xiàn)明顯癥狀[3],且經(jīng)常繼發(fā)或并發(fā)其他感染和疾患,導(dǎo)致病情加重,有的甚至短期內(nèi)死亡[4,5].

目前由于對附紅細(xì)胞體病了解甚少,己嚴(yán)重造成臨床上亂用和濫用各種抗寄生蟲藥物和抗微生物藥物,這有可能導(dǎo)致藥物殘留和危害食品安全[6].尋求一種簡便、高效的治療豬附紅細(xì)胞體的中藥方劑勢在必行,我們進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn),為找到治療附紅細(xì)胞體病的合適藥物和治療方法提供一定的理論根據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

小白鼠：河北北方學(xué)院物資科動物室繁殖的昆明種,體重為18～25 g的健康小白鼠,雌雄各半.

藥物：金銀花、野菊花、青蒿、生地、魚腥草、柴胡、常山、檳榔、大黃、芒硝、黃芩、連翹、石膏、苦參、當(dāng)歸、黃芪、川芎、赤勺、甘草等方藥組成.所有中藥均購自張家口市南山堂大藥房.

1.2 方法

1.2.1 自擬復(fù)方中藥的篩選試驗(yàn)

1.2.1.1 豬附紅細(xì)胞體陽性血液樣本的制備

無菌采取有明顯臨床癥狀的豬血液,用檸檬酸—檸檬酸鹽—葡萄糖 (ACD)抗凝 (ACD與血液比為1∶5).經(jīng)血液壓滴標(biāo)本檢查,400倍鏡下觀察紅細(xì)胞感染附紅細(xì)胞體在90%以上.試驗(yàn)時(shí)每只小白鼠腹腔注射0.5 m l豬附紅細(xì)胞體陽性血液.

1.2.1.2 復(fù)方中藥的制備

金銀花、野菊花、青蒿、生地、魚腥草、柴胡、常山、檳榔、大黃、芒硝、黃芩、連翹、石膏、苦參、當(dāng)歸、黃芪、川芎、赤勺、甘草等方藥,經(jīng)鑒定后組成方劑1、方劑2,煎成湯劑,保存于4℃冰箱備用.

1.2.1.3 試驗(yàn)動物分組

將60只感染小白鼠隨機(jī)分為3組,每組20只,第1組為附紅細(xì)胞體陽性對照組;第2組為方劑1治療組;第3組為方劑2治療組.治療組在感染附紅細(xì)胞體4 h后灌胃,每次0.5 m l,連續(xù)5天給藥,每天1次;另取20只未感染小白鼠作為生理鹽水對照組.灌胃方法及用藥劑量同治療組.

1.2.2 復(fù)方中藥的安全性試驗(yàn)

1.2.2.1 急性毒性試驗(yàn)

復(fù)方中藥水煎液的制備 將配好的復(fù)方中藥置砂鍋內(nèi),加入6～8倍的冷水浸泡30～60 min,用火加熱,開始用強(qiáng)火,沸后改用文火,煮沸30 min,用紗布過濾.藥渣加3～5倍量水繼續(xù)按上法煎煮,沸后煎煮30 min,濾過,合并得兩次濾液,于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原藥材1 g的藥液,即配成100%的水煎劑,經(jīng)高壓滅菌20 m in,冷卻后置冰箱中備用.試驗(yàn)前按需要稀釋.

復(fù)方中藥醇提液的制備 取原藥100 g,加95%乙醇200 m l浸泡24 h,傾取上層液過濾于蒸發(fā)皿內(nèi),殘留再加100 m l乙醇提取二次,合并提取液濾液,自然干燥得提取物.提取率為9.12%.臨用前按需要進(jìn)行稀釋.

動物分組 取健康小白鼠30只,雌雄各半,隨機(jī)分成6組,每組5只,分別采用水煎劑灌胃和腹腔注射醇提液兩種給藥途徑,按kg體重5g、15g和20g三個(gè)劑量,加適當(dāng)倍數(shù)的水使每只小白鼠灌胃量在0.4～0.8 m l.醇提液加注射用水適量使每只小白鼠注射量也為0.4～0.8 m l.

1.2.2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)

取健康小白鼠48只,雌雄各半,隨機(jī)分為三組,每組16只,第1組為對照組,第2組和第3組分別將復(fù)方中藥按10%和20%比例混入小白鼠飼料中,然后做成塊狀飼料喂給小白鼠,組內(nèi)雌雄分開飼喂,喂養(yǎng)期90 d.

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥的篩選試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 自擬方劑對正常小白鼠的影響

復(fù)方中藥陰性對照組小鼠在給藥期間未出現(xiàn)異常反應(yīng),小鼠存活時(shí)間與正常小鼠存活時(shí)間差異無顯著性 (P＞0.05),表明自擬方劑對小鼠無明顯毒害作用.

2.1.2 自擬方劑對感染小白鼠附紅細(xì)胞體的殺滅效果

陽性組小白鼠人工感染附紅細(xì)胞體后的第2～3 d,經(jīng)血液壓滴標(biāo)本檢查,可見紅細(xì)胞有附紅細(xì)胞體感染,在感染后的第4～5 d紅細(xì)胞感染率達(dá)到80%,第6～7 d紅細(xì)胞感染率相繼達(dá)到90%以上,紅細(xì)胞上的附紅細(xì)胞體附著個(gè)數(shù)最高達(dá)20個(gè).方劑1治療組第2 d之后感染率逐漸下降,但一直維持在20%～10%之間;方劑2治療組小白鼠在用藥后第1 d紅細(xì)胞感染率就迅速下降,第5 d感染率下降至2%,生理鹽水對照組一直處于0.結(jié)果見表1.

表1 自擬方劑對感染小白鼠附紅細(xì)胞體的治療效果單位：感染率/%

2.2 復(fù)方中藥的安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 急性毒性試驗(yàn)

用藥后每天觀察小白鼠的狀況,連續(xù)7 d,各組小白鼠均無死亡,未出現(xiàn)中毒癥狀.在此基礎(chǔ)上,另取20只小白鼠分成兩組,按kg體重20 g劑量采用上述兩種途徑給藥,24 h內(nèi)未見死亡,72 h后又重復(fù)給藥一次,并連續(xù)觀察7 d,小白鼠無死亡,且健康活潑,食欲良好.結(jié)果表明,該復(fù)方中藥LD50＞20 g/kg,按急性毒性分級屬無毒物.

2.2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

臨床檢查在90 d試驗(yàn)期內(nèi)觀察,各組小白鼠飲食、糞便、體態(tài)、運(yùn)動、聲、光反射均未見異常,無死亡.

血常規(guī)檢查 試驗(yàn)喂養(yǎng)90 d進(jìn)行,結(jié)果見表2.

表2 血常規(guī)檢查結(jié)果

由表2可知,各組血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)均屬正常.

肝體比、腎體比 在第90d進(jìn)行測定,結(jié)果見表3.

對表2和表3結(jié)果分別與1組進(jìn)行t檢驗(yàn),P＞0.05,說明兩試驗(yàn)組的肝體比和腎體比均屬正常.

尸體剖檢 采血致死后尸體剖檢,各組小白鼠心、肝、脾、肺和腎的大小、顏色、質(zhì)地均未見異常.

病理組織切片 檢查取肝、腎材料,用石蠟切片法制成組織切片,經(jīng)蘇木精-伊紅 (HE)染色,顯微鏡下檢查,三組均未見異常.

表3 肝體比、腎體比測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

中獸醫(yī)理論認(rèn)為附紅細(xì)胞體病屬溫?zé)岚Y,熱勢偏盛,是由感受外邪,燔灼氣血所致,臨床特征是發(fā)熱、貧血、黃疽、紅細(xì)胞自凝和紅細(xì)胞的沉降率增加,缺乏血紅蛋白.本方劑所選中草藥可達(dá)到解表、涼血、清里、滋陰等作用[7].其中金銀花、野菊花清熱解毒;魚腥草清肺熱;生地補(bǔ)陰涼血;青蒿、常山抗原蟲;大黃、芒硝清熱通便;柴胡、茵陳、常山、檳榔透解邪熱,疏達(dá)經(jīng)氣,祛邪解毒;丹皮、黃芩清泄邪熱,涼血化瘀.另據(jù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道表明：天花粉、黃芪等中草藥對紅細(xì)胞免疫功能具有增強(qiáng)作用[8].

試驗(yàn)觀察了自擬方劑對感染小白鼠附紅細(xì)胞體的殺滅效果,結(jié)果表明方劑1治療組第2 d之后感染率逐漸下降,但一直維持在20%～10%之間;方劑2治療組小白鼠在用藥后第1 d紅細(xì)胞感染率就迅速下降,第5 d感染率下降至2%.自擬方劑陰性對照組小鼠在用藥期間無任何不良反應(yīng),且其生存時(shí)間與正常小鼠生存時(shí)間一致,表明自擬方劑本身毒性較小,因此復(fù)方中藥是低毒,療效確切的抗附紅細(xì)胞體藥物,為臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù).

復(fù)方中藥對小鼠進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn),采用水煎劑和醇提液兩種給藥途徑,按kg體重5 g、15 g和20 g三個(gè)劑量以及在90 d試驗(yàn)期內(nèi)的觀察.結(jié)果表明,用藥后各組小白鼠均無死亡,未出現(xiàn)中毒癥狀.血常規(guī)檢查、肝體比、腎體比、尸體剖檢、病理組織切片檢查均無異常.說明該復(fù)方藥物在適宜劑量時(shí)屬無毒物.

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[2] 方素芳,崔平.河北省豬附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查 [J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2007,23(01)：38-40

[3] 程海慶,郝瑞芳,李海峰.豬弓形蟲與附紅細(xì)胞體病混合感染的診治 [J].河南畜牧獸醫(yī),2002,23(09)：12

[4] 李星,李鄒然.豬偽狂犬病病毒和附紅細(xì)胞體混合感染的診斷 [J].中國獸醫(yī)科技,200l,32(09)：31

[5] 王永撣,陳保國,張新疆,等.豬鏈球菌與附紅細(xì)胞體混合感染的診治 [J].河南畜牧獸醫(yī),2001,23(03)：23

[6] 鄭海紅.豬附紅細(xì)胞體體外培養(yǎng)及有效藥物篩選研究.[D].鄭州：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005

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[8] 王彩虹.紅細(xì)胞免疫調(diào)控研究進(jìn)展 [J].中國獸醫(yī)雜志,2002,28(02)：28-31