黃鱔性逆轉(zhuǎn)研究進(jìn)展

程 翠，曲憲成

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

黃鱔（Monopterus albus），隸屬硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes）輻鰭亞綱（Actinopterygii）合鰓目（Synbranchiformes）合鰓科 （Symbranchidae）黃鱔屬（Monopterus），為溫?zé)釒У~(yú)類。它不像其他動(dòng)物那樣終生屬于一個(gè)性別，一般認(rèn)為它第一次性成熟為雌性，以后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌?，其中間轉(zhuǎn)變階段叫雌雄間體，這種由雌到雄的轉(zhuǎn)變叫性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們過(guò)量地捕捉野生黃鱔以及黃鱔生活的水域環(huán)境由于大量施用農(nóng)藥等原因，生態(tài)條件受到嚴(yán)重破壞，其自然資源已日益下降，不能很好地滿足市場(chǎng)對(duì)養(yǎng)殖所需苗種的需求[1]。在一定程度上，明確黃鱔性逆轉(zhuǎn)機(jī)理將有助于解決黃鱔苗種問(wèn)題。因此很多研究工作者從各個(gè)方面對(duì)黃鱔的性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行了研究，筆者主要從組織學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和分子生物學(xué)等水平上概述黃鱔性逆轉(zhuǎn)的研究現(xiàn)狀。

1 性逆轉(zhuǎn)時(shí)性腺的組織學(xué)研究

黃鱔為相隨性雌雄同體，且是雌性先熟型雌雄同體，即從胚胎到第一次性成熟期都是雌性，雌性性成熟產(chǎn)卵后，卵泡敗育，卵巢逐漸退化，同時(shí)，分布于生殖腺上的原始精原細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育，形成精小囊，此時(shí)殘留的雌性生殖細(xì)胞與發(fā)育的雄性生殖細(xì)胞共同存在于生殖囊腔內(nèi)，為雌雄間性發(fā)育階段，然后向雄性過(guò)渡，這一發(fā)育過(guò)程是單向的，即發(fā)生性變化后不再由雄性個(gè)體逆返為雌性個(gè)體[2]。

肖亞梅[3]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃鱔生殖腺初始發(fā)生時(shí)，最早形成兩條獨(dú)立的生殖腺體，在發(fā)育過(guò)程中這兩條生殖腺的系膜合并，但兩生殖腺的腺體部分仍是分離的。結(jié)果還指出，無(wú)論是在雌性發(fā)育階段，還是性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌院?，這兩條生殖腺的腺體部分在結(jié)構(gòu)和功能上皆保持相互獨(dú)立的狀態(tài)，均具有正常的生殖功能。原始生殖細(xì)胞的命運(yùn)由它們?cè)谏诚亳拗械奈恢盟鶝Q定，發(fā)育為卵原細(xì)胞的原始生殖細(xì)胞位于生殖褶的外周部分，而那些后來(lái)發(fā)育成精原細(xì)胞的原始生殖細(xì)胞則在生殖褶的較中間部分。

關(guān)于性別變化過(guò)程中生殖細(xì)胞的來(lái)源，Shapiro[4]認(rèn)為有兩種可能：一是在初始性腺發(fā)育時(shí)，就存在著一個(gè)靜止的、具有雙潛能性的細(xì)胞庫(kù)。性變化發(fā)生時(shí)，這些細(xì)胞分化為適宜的生殖細(xì)胞；二是在發(fā)育早期，產(chǎn)生兩套分化了的細(xì)胞，并共存于一成體性別中，當(dāng)?shù)诙滓逊只募?xì)胞增殖并擴(kuò)散到整個(gè)性腺時(shí)，就發(fā)生了性的變化。顯然肖亞梅支持上述第二種觀點(diǎn)。而呂道遠(yuǎn)[5]在對(duì)黃鱔性腺自然逆轉(zhuǎn)過(guò)程中vasa基因的表達(dá)進(jìn)行分析研究的結(jié)果表明，黃鱔的雄性生殖細(xì)胞可能起源于雌性階段卵巢被膜中的原始生殖細(xì)胞，則傾向于上述第一種觀點(diǎn)。

隨著研究的深入，關(guān)于黃鱔的生殖腺發(fā)育狀況有了一種新的報(bào)道，即黃鱔個(gè)體生殖腺內(nèi)同時(shí)具有產(chǎn)后卵巢和產(chǎn)后精巢結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象[6]。

2 性逆轉(zhuǎn)的內(nèi)分泌學(xué)研究

一些學(xué)者通過(guò)對(duì)黃鰭性腺和垂體的形態(tài)和分泌功能的研究后，認(rèn)為下丘腦-垂體軸在性逆轉(zhuǎn)的引發(fā)中可能具有重要作用，同時(shí)指出性類固醇激素和促性腺激素是誘發(fā)黃鱔性逆轉(zhuǎn)的可能因素[7]。從這些方面出發(fā)，許多學(xué)者進(jìn)行了以下各項(xiàng)研究。

2.1 性逆轉(zhuǎn)與血清蛋白的關(guān)系

鄒紀(jì)興[8]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)黃鱔的血清蛋白進(jìn)行分析顯示：雌雄間體的黃鱔血清蛋白組分比雌雄單體的組分有所增加，增加的組分位于正負(fù)極之間的球蛋白部分，這一現(xiàn)象可能是由于在逆轉(zhuǎn)過(guò)程中雌雄兩性的性激素同時(shí)存在，它們同時(shí)影響著機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的合成，從而增加了血清中蛋白質(zhì)的組分。而雄鱔中存在著一種分子量不同于雌性、種類更多的蛋白質(zhì)，從電泳圖上它位于負(fù)極一端，且分子量較大，是一類糖脂蛋白，這種糖脂蛋白從電泳及掃描圖上看，雌鱔中幾乎沒(méi)有。雌雄間體早期開(kāi)始出現(xiàn)，此后逐漸增加，性逆轉(zhuǎn)后的雄鱔血清蛋白質(zhì)中糖脂蛋白的含量達(dá)到最高值，無(wú)疑這種雄性特異的糖脂蛋白類與黃鱔性逆轉(zhuǎn)之間存在著一定的關(guān)系，但它是性逆轉(zhuǎn)的啟動(dòng)因子或輔助因子，還是性逆轉(zhuǎn)后的結(jié)果，還有待研究[9]。

2.2 性逆轉(zhuǎn)與性腺蛋白的關(guān)系

宋平等[11]采用聚丙烯酰胺梯度膠電泳方法，對(duì)262尾黃鱔的性腺蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明雌性黃鱔隨著性腺的成熟性腺蛋白組分有所增多，相反雄性黃鱔隨著性腺的成熟其性腺蛋白組分有所減少；間性期性腺蛋白組分明顯增加，其增加的蛋白帶為一組位于凝膠偏負(fù)極端、分子較相近的蛋白分子，性逆轉(zhuǎn)時(shí)精巢的組建可能與這組蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)。

2.3 內(nèi)源性激素與黃鱔自然性逆轉(zhuǎn)的關(guān)系

陶亞雄等[11-12]認(rèn)為下丘腦—腦垂體系統(tǒng)可能在誘發(fā)黃鱔性轉(zhuǎn)變過(guò)程中起極其重要的作用，并且指出促性腺激素釋放激素（GnRH）是一個(gè)關(guān)鍵的因子。黃鱔垂體中有兩種類型的促性腺激素（GTH）分泌細(xì)胞[13]，分別分泌卵泡刺激素（FSH）和促黃體素釋放激素（LH）。雌鱔垂體的LH活性可觸發(fā)間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，還可能觸發(fā)靜止的精原細(xì)胞的發(fā)育，從而促其自然性轉(zhuǎn)變[14]。而哺乳動(dòng)物的LH和FSH也可以誘導(dǎo)黃鱔間質(zhì)細(xì)胞和其他雄性精原細(xì)胞提前發(fā)育[15]。

對(duì)黃鱔血清睪酮（簡(jiǎn)稱T）和雌二醇（簡(jiǎn)稱E2）的含量周年測(cè)定表明，雌性黃鱔血清T值在繁殖季節(jié)前期2～3個(gè)月平均含量高，而沒(méi)有性逆轉(zhuǎn)的魚(yú)類此時(shí)卻很低，原因是黃鱔的卵巢內(nèi)精巢組織開(kāi)始分化，同樣在繁殖季節(jié)后兩個(gè)月血清T含量較高，也與卵巢內(nèi)精巢組織分化有關(guān)；雄性黃鱔血清E2水平在5月份高于T值，這與性腺中殘留的卵巢繼續(xù)分泌E2有關(guān)[16]。石瓊等[17]提出黃鱔體內(nèi)各組織中褪黑激素水平皆顯示出生殖季節(jié)性變化，褪黑激素對(duì)黃鱔血清性T和E2水平具有一定的刺激作用，并且褪黑激素影響黃鱔性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間可能是性腺靜止期（IV期或之前）。

性類固醇激素也對(duì)黃鱔性轉(zhuǎn)變有影響，雌鱔具有較低的雄激素合成能力，性改變?cè)缙谛奂に睾铣闪咳匀缓苌?，大部分是雄烯二酮；而在雄性期，約三分之一的代謝產(chǎn)物是11-酮睪酮，還有較多的腎上腺雄酮，說(shuō)明性轉(zhuǎn)變時(shí)類固醇激素也發(fā)生變化。另外，雄烯二酮在產(chǎn)卵前雌性期和性轉(zhuǎn)變?cè)纭⒅衅谘獫{中的水平明顯升高，而在性改變后期和雄性期又迅速下降。因此，其也可能與黃鱔性轉(zhuǎn)變有關(guān)[18]。

2.4 外源激素對(duì)黃鱔性逆轉(zhuǎn)的影響

2.4.1 雌性激素 雌性激素可誘導(dǎo)魚(yú)類雌性化，阻礙黃鱔性逆轉(zhuǎn)。趙云芳等在研究激素誘導(dǎo)黃鱔性轉(zhuǎn)化時(shí)，利用乙烯雌酚注射產(chǎn)卵后的鱔魚(yú)，發(fā)現(xiàn)鱔魚(yú)卵巢繼續(xù)發(fā)育，雌激素推遲了黃鱔性逆轉(zhuǎn)期，使其再次產(chǎn)卵。而用乙烯雌酚注射未產(chǎn)卵的雌鱔，用藥的試驗(yàn)組均比對(duì)照組生長(zhǎng)更快，體重增加，而且卵巢大，懷卵量多。因此得出結(jié)論，雌激素對(duì)黃鱔有加快生長(zhǎng)，推遲性轉(zhuǎn)化，激發(fā)雌性發(fā)育，增加產(chǎn)鱔苗的作用[19]。

2.4.2 雄性激素 據(jù)Tang等報(bào)導(dǎo)多種雄性激素（甲基睪酮、睪酮和11-酮睪酮）均對(duì)成鱔提早性轉(zhuǎn)化無(wú)效。但對(duì)黃鱔胚胎后期以及仔鱔進(jìn)行雄激素處理，可以促使黃鱔提早性轉(zhuǎn)換[19]。一般雄鱔成熟時(shí)間為2～3 a，而經(jīng)過(guò)處理的黃鱔不需經(jīng)過(guò)雌鱔產(chǎn)卵這個(gè)環(huán)節(jié)，幾個(gè)月至一年時(shí)間就可獲成熟雄鱔。但相對(duì)金魚(yú)、羅非魚(yú)100%的轉(zhuǎn)化率，黃鱔的轉(zhuǎn)化率就很低了，原因還有待繼續(xù)研究試驗(yàn)。

2.4.3 其他激素 石瓊等[17]在褪黑激素對(duì)黃鱔性腺發(fā)育影響研究中，發(fā)現(xiàn)處于不同性腺發(fā)育時(shí)期的黃鱔對(duì)外源褪黑激素的反應(yīng)存在生殖季節(jié)性差異，褪黑激素對(duì)IV期或IV期之前黃鱔的性腺發(fā)育有劑量依存的促進(jìn)和抑制的雙重調(diào)節(jié)作用，低劑量促進(jìn)性轉(zhuǎn)變，高劑量抑制性轉(zhuǎn)變。但對(duì)排卵前期（V期）個(gè)體沒(méi)有顯著影響。此外，陶亞雄等[14]利用鯉魚(yú)垂體勻漿，人絨毛膜促性腺激素和鮭魚(yú)促性腺激素釋放激素類似物等幾種外源性激素注射，結(jié)果均增加了黃鱔血清性類固醇激素的水平，說(shuō)明GnRH對(duì)雌鱔GTH有影響。但有關(guān)GnRH調(diào)控作用的詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

3 黃鱔性逆轉(zhuǎn)在基因表達(dá)水平上的研究

3.1 SRY/sry基因

張勇等以人和鼠的SRY片段為探針與黃鱔基因組DNA進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)雌雄黃鱔中均有相同的雜交帶，用1對(duì)SRY基因保守區(qū)HMGbox引物，在雌雄黃鱔的基因組DNA中，均擴(kuò)增出200bp的片段，將此片段克隆測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)雌雄個(gè)體中，此片段僅相差1個(gè)堿基，且與人的SRY基因HMG盒基因極為相似。以該片段與雌雄個(gè)體的RNA進(jìn)行Northern雜交，未能檢測(cè)到雜交帶，RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出微弱的200 bp片段，表明在雌雄黃鱔的基因組DNA中均存在SRY同源片段，黃鱔中的SRY同源片段可能與其性別無(wú)直接關(guān)系，而是具備其他功能[20]。

3.2 Dmrt1基因

Dmrt1基因幾乎在所有后生動(dòng)物的性別發(fā)育機(jī)制中都存在，是目前為止唯一己知的在各個(gè)進(jìn)化地位的物種中都參與了性別發(fā)育過(guò)程的基因。黃曉等利用mRNA組織原位雜交發(fā)現(xiàn)黃鱔的Dmrt1基因在生殖褶的某些細(xì)胞中表達(dá)，而在生殖細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。根據(jù)進(jìn)化保守性分析，認(rèn)為在黃鱔中Dmrt1基因與性腺結(jié)構(gòu)的形成、生殖細(xì)胞的產(chǎn)生和分化有關(guān)。在不同性別的性腺中，四種不同形式的轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)定量分析表明黃鱔Dmrtl基因具有不同的表達(dá)模式：雌性為rDmrtl d>rDmrtl a>rDmrtl c>rDmrtl b，間性為 rDmrtl a>rDmrtl c>rDmrtl d>rDmrtl b，雄性為 rDmrtl a>rDmrtl b>rDmrtl d>rDmrtl c，這種表達(dá)模式的變化一定程度上反映了黃鱔的性別反轉(zhuǎn)的生理過(guò)程[21]。

3.3 核糖體蛋白基因

商璇等[22]采用高密點(diǎn)陣技術(shù)從黃鱔雄性性腺cDNA文庫(kù)中獲得8個(gè)克隆，序列分析和BLAST結(jié)果顯示，它們編碼的蛋白質(zhì)分別與40 S核糖體蛋白 S4、S9、S16、S17、S20 和 60 S 核糖體蛋白 L7、L18a、L29高度同源。根據(jù)黃鱔核糖體蛋白序列和其他物種的相應(yīng)同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示：核糖體蛋白基因在進(jìn)化中高度保守，核糖體蛋白基因不僅可作為分子進(jìn)化分析的有利工具，而且從它們的表達(dá)模式顯示核糖體蛋白基因除具有看家基因的功能外，很有可能參與包括性腺分化等過(guò)程的發(fā)育調(diào)控。

3.4 芳香化酶基因

Liu等[23]利用熒光定量技術(shù)分析了芳香化酶基因P450arom和P45011β在黃鱔不同發(fā)育時(shí)期的性腺中表達(dá)量，結(jié)果顯示P450arom在卵巢中大量表達(dá)，在間期性腺中表達(dá)量明顯減弱，而在精巢中幾乎不表達(dá)；P45011β的表達(dá)情況則恰恰相反，其在卵巢向精巢逆轉(zhuǎn)的過(guò)程中，表達(dá)量明顯增加。此研究在一定程度上進(jìn)一步說(shuō)明了類固醇在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中起著重要作用，特別是P450arom和P45011β量的變化對(duì)黃鱔的性逆轉(zhuǎn)有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，由于黃鱔資源的日趨下降，養(yǎng)殖市場(chǎng)對(duì)黃鱔苗種的需求越來(lái)越緊張，人工繁殖顯得非常重要。但黃鱔具有特殊的生理現(xiàn)象，并且在雌性時(shí)期個(gè)體小，由此所帶來(lái)數(shù)量有限的懷卵量，這給黃鱔的人工繁殖帶來(lái)不便。因此，為解決黃鱔的苗種問(wèn)題，有必要明確黃鱔性逆轉(zhuǎn)的內(nèi)分泌機(jī)理，同時(shí)利用生物學(xué)等知識(shí)來(lái)改變或控制黃鱔的性別來(lái)延長(zhǎng)或者使黃鱔終生為雌性，以便滿足養(yǎng)殖行業(yè)對(duì)黃鱔苗種的需求。

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