牛朊蛋白基因prnp敲除載體的構(gòu)建及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染

張海林，程胖，蘭杰，宋永利，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生殖生理與胚胎工程重點實驗室，楊凌 712100

基因敲除又稱基因打靶 (Gene targeting) 技術(shù)，是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，精細(xì)地定點修飾和改造基因DNA片段的技術(shù)。它是在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，最早應(yīng)用于小鼠上。基因打靶過程中，打靶載體和打靶位點之間的重組是一個非常復(fù)雜的過程。在哺乳動物中，隨機重組的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同源重組的頻率，是同源重組的30~40 000倍，可見載體和打靶位點之間的重組大部分為非同源重組[1]。因此，為了富集同源重組事件，人們相繼建立了不同的基因打靶篩選策略，目前主要的富集策略有正負(fù)篩選策略 (Positive-negative selection，PNS)、啟動子捕獲、Poly-A 捕獲等[2]。正負(fù)篩選策略 (PNS)是目前應(yīng)用較廣泛的一種策略，同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內(nèi)。置換型載體含有正負(fù)選擇基因各一，正選擇基因多為 neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達；負(fù)選擇基因在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的 3′末端，常用HSV-tk基因，在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，相反在隨機整合時，所有的序列均保留 (包括tk)，胸苷激酶蛋白 (TK) 可使無毒的丙氧鳥苷(GANC) 轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账?，從而殺死?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機整合的細(xì)胞株。故同源重組時，對G418和GANC都有抗性；隨機整合時，對G418有抗性，但對GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無整合的細(xì)胞將被G418殺死[3]。用G418作正篩選，選出含有 neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株，從而篩選出中靶細(xì)胞，達到對陽性細(xì)胞進行富集的目的。

朊蛋白 (Prion protein) 是動物傳染性海綿狀腦病的致病蛋白，是由prnp 基因編碼的一種糖蛋白。牛的傳染性海綿狀腦病 (BSE) 俗稱瘋牛病，是一種嚴(yán)重危害人類健康和世界經(jīng)濟發(fā)展的傳染性疾病。瘋牛病1986年首次在英國發(fā)現(xiàn)，隨后大面積爆發(fā)，到目前為止，已經(jīng)有24個國家先后報道發(fā)現(xiàn)瘋牛病[3]。因此，這一疾病引起了世界許多課題組的關(guān)注和研究，其中，應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)對瘋牛病具有抵抗能力的“超級?！背蔀檠芯康囊粋€最大熱點。大量研究表明，該病的病原體是PrPsc——一種內(nèi)源性膜錨定蛋白PrPc (由prnp基因編碼) 的異構(gòu)體，其發(fā)病過程中的主要事件就是 PrPsc誘導(dǎo)的 PrPc向PrPsc的轉(zhuǎn)化[4]。因此，科學(xué)家推斷PrPc缺失的動物因缺乏轉(zhuǎn)化的底物而可能具有抵抗Prion病的能力。

本研究旨在利用Cre-Loxp重組系統(tǒng)的原理[5]構(gòu)建奶牛朊蛋白基因prnp敲除載體，再通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)正負(fù)雙向篩選最終獲得陽性細(xì)胞克隆，為體細(xì)胞核移植生產(chǎn)敲除朊蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物提供供體細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

打靶載體PA2T、牛胎兒成纖維細(xì)胞，菌株DH5α均為本實驗室保存。EX Taq酶、pMD20-T Vector、DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，各種限制性內(nèi)切酶購自MBI公司，B型小量質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒及多種DNA marker購自 Tiangen公司，其中 1 kb DNA marker購自MBI公司。

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：基本培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素均購自Gibico公司，G418購自Invitrogen公司，其他試劑購自Sigma等公司。

引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，基因測序工作由南京金思特生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 基因組DNA的提取

無菌制備荷斯坦奶?？鼓?，從中提取基因組DNA，按TIANGEN公司的血液?細(xì)胞?組織基因組提取試劑盒說明書進行操作。

1.3 prnp基因打靶載體PBONP的構(gòu)建

1.3.1 3'同源臂和5'同源臂的PCR擴增及克隆

分別設(shè)計上、下游引物 (模板序列 GenBank Accession No. AJ 298878)如下：3′同源臂引物short1：5′-atcgat TAATCTTTACCAGGTTGGGGGAGGG-3′(31 bp)，下劃線部分表示Cla I限制性內(nèi)切酶識別位點。Short2：5′-actagt CCTGGCAAGAATACTGGAG TGGGTT-3′(31 bp)。下劃線部分表示Spe I限制性內(nèi)切酶識別位點。5′同源臂引物 long1:5′-ggcgcgcc TTGGACTAAAGTCAATGTATGTGGC-3′(33 bp)，下劃線部分表示 sgs I限制性內(nèi)切酶識別，Long2: 5′-gcggccgc CTAGAAACTCTGCCTATTGGGTTGT-3′(33 bp)，下劃線部分表示Not I限制性內(nèi)切酶識別位點。均為25 μL反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，EX Taq酶12.5 μL，高壓滅菌ddH2O 8.5 μL。3′同源臂擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)。5′同源臂擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，62℃退火35 s，72℃延伸4 min，30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD20-T Vevtor載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定 3′、5′同源臂插入正確的克隆分別稱為 pMD20-T-3prnp和pMD20-T-5prnp。

1.3.2 3'、5'同源臂插入打靶載體PA2T

將測序正確的克隆的質(zhì)粒pMD20-T-3prnp與打靶載體PA2T同時用Cla I、Spe I雙酶切，分別回收1727 bp的3′同源臂和8538 bp的骨架載體片段，按照摩爾比3:1的比例16℃經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化 DH5α，提取質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定，3′同源臂序列插入正確的克隆稱為PA2Tprnps。

將測序正確的克隆的質(zhì)粒pMD20-T-5prnp與質(zhì)粒PA2Tprnps同時用sgs I、Not I雙酶切，分別回收3860 bp的5′同源臂和10265 bp 的線性PA2Tprnps片段，按照摩爾比3:1的比例16℃經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化 DH5α，提取質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定5′同源臂序列插入正確的克隆稱為PBONP。

1.3.3 基因操作

PCR產(chǎn)物回收、連接反應(yīng)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定等技術(shù)參照相關(guān)試劑盒說明書進行。

1.4 打靶載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞

1.4.1 轉(zhuǎn)染與細(xì)胞篩選

牛胎兒成纖維細(xì)胞在含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至 70%~80%時按照電穿孔的操作說明書進行經(jīng)Sac II線性化的空質(zhì)粒和打靶載體的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后用含600 μg/mL的Geneticin的細(xì)胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿70%時進行傳代，一直培養(yǎng)7 d；再用含300 μg/mL 的Geneticin和200 nmol/mL的GV細(xì)胞培養(yǎng)液替代600 μg/mL的Geneticin的細(xì)胞培養(yǎng)液進行篩選，每日更換培養(yǎng)液清除死亡的細(xì)胞，當(dāng)篩選7 d后3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，直至細(xì)胞皿70%長滿陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，傳代和凍存，用于后續(xù)檢測。

1.4.2 細(xì)胞單克隆培養(yǎng)

牛胎兒成纖維細(xì)胞在 24孔板中培養(yǎng)至 40%，用5 mg/mL絲裂霉素C處理2 h，去除含絲裂霉素C的細(xì)胞培養(yǎng)液后用PBS清洗6次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2次，確保完全去除絲裂霉素C；用顯微操作儀挑取單個細(xì)胞放于用絲裂霉素C處理過的培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)，用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，3 d更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液直至皿底80%長滿細(xì)胞，傳代，用含300 μg/mL的Geneticin和100 nmol/mL的GV細(xì)胞培養(yǎng)液替代細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，殺死基因沒有定點整合的細(xì)胞，得到中靶的純克隆株。

1.5 陽性細(xì)胞克隆的鑒定

1.5.1 陽性細(xì)胞克隆的PCR及測序鑒定

按照基因組提取試劑盒說明書從待鑒定細(xì)胞中提取細(xì)胞基因DNA，根據(jù)GenBank中公布的牛 prnp序列(Accession No. AJ298878)設(shè)計鑒定引物：check1:5′-CCTGGCAAGAATACTGGAGTGGG-3′；check2:5′-TCAATCCGTAGCGATCAAGGAAG-3′。其中check1位于3'同源臂外側(cè)，check2位于neo表達框架內(nèi)。反應(yīng)體系同上；94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，59℃退火35 s，72℃延伸2 min40 s，30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD20-T Vevtor載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，抽提質(zhì)粒，進行酶切，PCR及測序鑒定。

1.5.2 陽性細(xì)胞克隆的間接免疫熒光實驗鑒定

將篩選出的單克隆細(xì)胞接種于 6孔板，待細(xì)胞長滿載玻片的80%時將細(xì)胞爬片從6孔培養(yǎng)板中取出，37℃下用0.01 mol/L PBS 洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)洗滌和3% H2O2阻斷后，用1% BSA-PBST封閉20 min，加入1∶200稀釋的小鼠抗牛P6488單克隆抗體，4℃反應(yīng)過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG熒光抗體，37℃孵育1 h (避光)，PBST充分洗滌后，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照。

1.5.3 陽性細(xì)胞克隆的Western blotting鑒定

將篩選出的單克隆細(xì)胞胰酶消化，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液 (150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，5 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)，冰浴上裂解細(xì)胞30 min，15 000 r/min離心10 min，收獲上清液，采用Brandford法測定蛋白含量，進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 (NC) 膜上，PBST (含 0.01% Tween20的PBS) 洗滌后，于封閉液 (含5%脫脂奶粉的PBST) 中4℃過夜。加入小鼠抗牛P6488單克隆抗體，室溫孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌加入HRP-羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h，PBST洗滌后，二氨基聯(lián)苯二胺(DAB) 顯色、成像。

2 結(jié)果

2.1 奶牛朊蛋白基因prnp敲除載體的構(gòu)建

2.1.1 質(zhì)粒pMD20-T-3prnp的構(gòu)建

以?；蚪M DNA為模板擴增的 3′同源臂長1727 bp (圖1A)，直接將PCR得到的目的片段連入打靶載體中需要進行大量的PCR產(chǎn)物，因此，采用T載體克隆的方法以獲得足夠的3′同源臂片段。

圖1 3′同源臂的PCR和酶切鑒定Fig. 1 PCR and restriction endonuclease digestion of 3′homologous arm. (A) 1: DNA marker DL2000; 2: 3′homologous arm. (B) 1: DNA marker III; 2: pMD20-T-3prnp digested with Spe I/Cla I.

pMD20-T-3prnp全長4463 bp，用3′同源臂兩端的酶切位點Cla I和Spe I進行雙酶切將獲得1727 bp的3′同源臂片段和2736 bp的pMD20-T 載體片段(圖1B)。對pMD20-T-3prnp進行測序，結(jié)果表明插入片段為3′同源臂。

2.1.2 質(zhì)粒pMD20-T-5prnp的構(gòu)建

以?；蚪M DNA為模板擴增的 5′同源臂長3860 bp (圖2A)，同上，同樣采用T載體克隆的方法以獲得足夠的5′同源臂片段。

pMD20-T-5prnp全長6596 bp，用5′同源臂兩端的酶切位點Sgs I和Not I進行雙酶切將獲得3860 bp的 5′同源臂片段和 2736 bp的 pMD20-T載體片段(圖2B)。對pMD20-T-5prnp進行測序，結(jié)果表明插入片段為5′同源臂。

2.1.3 質(zhì)粒PA2T-prnps的構(gòu)建

將質(zhì)粒pMD20-T-3prnp經(jīng)過Cla I/Spe I雙酶切后，回收3′同源臂后將其連接到經(jīng)過Cla I/Spe I雙酶切的PA2T載體上，構(gòu)建成為PA2T-prnps，大小為10 265 bp。用Cla I/Spe I雙酶切可獲得1727 bp的3'同源臂片段和8538 bp的PA2T載體片段 (圖3A)，以PA2T-prnps為模板，short1和short2為上下游引物可擴增出大小為1727 bp的條帶 (圖3B)。

2.1.4 打靶載體的構(gòu)建

將質(zhì)粒pMD20-T-5prnp經(jīng)過Sgs I/Not I雙酶切后，回收5′同源臂并將其連接到經(jīng)過Sgs I/Not I雙酶切的PA2T-prnps載體上，構(gòu)建成為敲除載體，稱為PBONP，全長14 125 bp。將該質(zhì)粒用Sac II單酶切可獲得14 125 bp的片段 (圖4A)，用Sgs I/ Not I雙酶切后可獲得3860 bp 的5′同源臂片段和10 265 bp的PA2T-prnps載體片段 (圖4B)。

圖2 5′同源臂的PCR和酶切鑒定Fig. 2 PCR and restriction endonuclease digestion of 5' homologous. (A) 1: DNA marker III; 2: 5' homologous arm. (B) 1: 1 kb DNA marker (MBI); 2: pMD20-T-5prnp digested with Sgs I/Not I.

以PBONP質(zhì)粒為模版，long1和long2為上下游引物可擴增出大小為 3860 bp的條帶(圖 4C)，short1和 short2為上下游引物可擴增出大小為1727 bp的條帶 (圖4D)。

圖3 重組質(zhì)粒PA2T-prnps的PCR及酶切鑒定Fig. 3 PCR and restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid PA2T-prnps. (A) 1: 1 kb DNA ladder; 2: PA2T-prnps digested with Spe I/Cla I. (B) 1: DNA marker DL2000; 2: 3' homologous arm.

圖4 打靶載體PBONP的酶切和PCR鑒定Fig. 4 PCR and restriction endonuclease digestion of targeting vector PBONP. (A) 1: DNA marker DL15 000; 2: PBONP digested with Sac II. (B) 1: DNA marker DL15 000; 2: PBONP digested with Sgs I/Not I. (C) 1: DNA marker III; 2: 5′ homologous arm. (D) 1: DNA marker DL2000(DONGSHENG BIOTECH); 2: 3′homologous arm.

2.1.5 同源重組示意圖(5A)及打靶載體整體框架圖(5B)

2.2 打靶載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞篩選

2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和初步篩選

圖5 同源重組示意圖及打靶載體框架圖Fig. 5 Schematic diagram of homologous recombination region and targeting vector diagram. (A) Schematic diagram of homologous recombination region. (B) Targeting vector diagram.

圖6 細(xì)胞篩選液培養(yǎng)液培養(yǎng)牛胎兒成纖維細(xì)胞Fig. 6 Bovine fetal fibroblasts cultured by Geneticin cell nutrient solution. (A) BFFs transfected by PBONP cultured by selective solution containing Geneticin. (B) BFFs selected by Genticin cultured by selective solution containing GCV.

圖6A為經(jīng)SacⅡ線性化的基因打靶載體PBONP轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞后用600 μg/mL的Genticin的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng) 10 d后的情況；圖 6B為經(jīng)Genticin正向篩選后的細(xì)胞用300 μg/mL的Genticin和200 nmol/L的GVC細(xì)胞培養(yǎng)液進行篩選7 d后的情形，可見，最終轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在篩選液中存活并增殖。

2.2.2 PBONP的細(xì)胞單克隆培養(yǎng)結(jié)果

如圖 7所示，單個轉(zhuǎn)染打靶載體的細(xì)胞通過培養(yǎng)體系單克隆培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖，一段時間后，飼養(yǎng)層細(xì)胞衰老死亡，經(jīng)多次洗脫后洗去飼養(yǎng)層，留下了單克隆擴增的細(xì)胞克隆株。經(jīng)過12次大批量的電穿孔轉(zhuǎn)染實驗，一共得到176個藥物抗性細(xì)胞克隆，分別將每個單克隆細(xì)胞挑出來進行擴大培養(yǎng)用于后續(xù)檢測。

2.3 陽性細(xì)胞克隆的鑒定

2.3.1 單克隆細(xì)胞的PCR鑒定

分別從篩選出的單克隆細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取基因組DNA，以其為模板，以check1、check2為上下游引物分別進行PCR擴增。以陽性細(xì)胞基因擴增的產(chǎn)物長度為2594 bp，應(yīng)為3′同源臂、Loxp、PA和前部分neo的連接片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接到pMD20-T Vector、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α、質(zhì)粒抽提、進行酶切及測序鑒定后，結(jié)果顯示：176個細(xì)胞克隆中有 9個在同等條件下擴增出目的帶，而以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組為模板在其他條件都一樣的情況下擴增不出條帶 (圖8)，且PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定正確，由此初步證實這9個細(xì)胞克隆為陽性細(xì)胞克隆。

2.3.2 陽性細(xì)胞克隆的間接免疫熒光實驗鑒定

將篩選出的 9個細(xì)胞進行免疫熒光實驗，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。如圖9所示：經(jīng)過篩選的細(xì)胞均不發(fā)熒光，因為發(fā)生了同源重組的細(xì)胞中prnp基因的CDS區(qū)已被neo序列所取代，即細(xì)胞中的朊蛋白被敲除，不能進行抗原抗體反應(yīng)，所以就沒有熒光產(chǎn)生，反之，對照組產(chǎn)生熒光 (圖 9)。進一步證實這9個克隆為陽性細(xì)胞克隆。

圖7 單細(xì)胞培養(yǎng)時單個細(xì)胞增殖的結(jié)果Fig. 7 Result of single cell mitochysis in monoclonal culture.

2.3.3 陽性細(xì)胞克隆的Western blotting鑒定

將篩選出 9個單克隆細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用胰酶消化，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液，冰浴上裂解細(xì)胞 30 min，經(jīng)離心收獲上清，進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯色、成像，結(jié)果如圖10所示：9個陽性細(xì)胞樣 (1號) 均沒有出現(xiàn)目的蛋白帶 (31 kDa) 而2號未轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣有，原因同2.3.2中所述，證明了所得到的陽性細(xì)胞均發(fā)生了正確的同源重組。

圖8 單克隆細(xì)胞的PCR鑒定結(jié)果Fig. 8 Identification of positive cell clone by PCR. 1: DNA marker IV; 2: PCR gene product amplified as a template with positive cells; 3: result of single-enzyme digestion; 4: PCR gene product amplified as a template with cells transfected with empty vector.

圖9 免疫熒光試驗鑒定陽性細(xì)胞克隆Fig. 9 Immunofluorescence assay of the positive cells. (A) Immunefluorescence test of non-transfected cells. (B) Immunefluorescence test of selected cells.

圖10 陽性細(xì)胞的Western blotting鑒定結(jié)果Fig. 10 Western blotting results of the positive cells. 1: Western blotting of selected cells; 2: Western blotting of nontransfected cells; 3: standard prnp protein.

3 討論

瘋牛病是一種慢性的、致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。1997年，Bruce等[10]的研究證實，食用感染過瘋牛病的病牛的內(nèi)臟、脊髓等可以使人感染上類似瘋牛病的腦病 vCJD，這些腦病統(tǒng)稱 Prion疾病。在傳染性朊病毒病中，外源性 PrPsc在侵染機體后，首先與錨附在細(xì)胞表面的內(nèi)源性PrPc的C端第3個螺旋位點同源性特定AA相結(jié)合，形成雜合二聚體(Heterodimer)，然后，在“X蛋白”[6-7]和鹽酸胍、硫酸黏多糖、金屬離子、脂類分子、BCL-2等蛋白質(zhì)折疊因子及氧自由基[8]等作用下，以PrPsc為模板，自動催化以α螺旋為主的PrPc轉(zhuǎn)變成以β折疊為主的PrPsc。這種“策反”式復(fù)制是一種瀑布型指數(shù)式增殖過程[9]，即一個分子PrPsc產(chǎn)生出2個分子PrPsc，2個PrPsc再去結(jié)合2個PrPc，共產(chǎn)生出4個PrPsc，如此周而復(fù)始。因此，利用基因打靶技術(shù)將prnp敲除，生產(chǎn)對瘋牛病具有抗性的轉(zhuǎn)基因動物具有重大的意義。

1993年，Bueler等[11]首先利用基因打靶技術(shù)獲得了prnp-/-的小鼠，并且發(fā)現(xiàn)這些小鼠沒有明顯的發(fā)育和表型異常。隨后，Bueler等[11]、Prusiner等[12]的研究表明，這種prnp基因敲除或者缺失的小鼠都對Prion疾病的發(fā)生具有抗性。再后來，人們就嘗試?yán)没蚯贸夹g(shù)來剔除大家畜基因組prnp基因。2006年，上海轉(zhuǎn)基因研究中心的Yu等[13]利用基因敲除技術(shù)成功獲得了5只prnp-/+的山羊，經(jīng)過mRNA和蛋白水平的檢測，prnp 基因的表達都有明顯的下調(diào)，這些山羊并沒有出現(xiàn)發(fā)育和表型的異常，而且都已經(jīng)存活了3個月以上。本實驗室已經(jīng)建立了穩(wěn)定、高效的牛體細(xì)胞核移植技術(shù)平臺，所以希望在此基礎(chǔ)之上，嘗試?yán)没蚯贸夹g(shù)生產(chǎn)prnp基因敲除克隆牛。

牛prnp是單拷貝基因，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，其中795 bp的編碼區(qū) (Coding sequence，CDS)位于第 3個外顯子中。本實驗以通用型打靶載體PA2T為基本骨架成功構(gòu)建打靶載體PBONP，它由3.86 kb 的5′同源臂和1.727 kb的3′同源臂，以及位于其中的 neo基因表達框架構(gòu)成。載體中同時含有neo正篩選標(biāo)記基因和tk負(fù)篩選標(biāo)記基因，為篩選陽性細(xì)胞奠定基礎(chǔ)；先后用G418和GV進行正負(fù)篩選，結(jié)果獲得了大量的單克隆細(xì)胞，由此證實了PNS法是一種簡便、易行、有效的富集陽性細(xì)胞的方法。一旦打靶載體與牛prnp基因發(fā)生同源重組，則prnp的 CDS序列被 neo基因表達框架取代，致使 prnp基因不能表達，達到敲除prnp的目的。經(jīng)過后續(xù)的PCR、免疫熒光和Western blotting鑒定，證實了培養(yǎng)的176個單克隆細(xì)胞中有9個是發(fā)生了同源重組的陽性細(xì)胞，也就是中靶效率大約為 5%。將經(jīng)鑒定的陽性細(xì)胞于液氮中冷凍保存，交給胚胎移植組作為核移植的供體細(xì)胞。然而，轉(zhuǎn)基因隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，可能會影響供體細(xì)胞的遺傳學(xué)以及表觀遺傳學(xué)狀態(tài)，進而影響細(xì)胞核重編程以及以后在轉(zhuǎn)基因動物個體水平上的表達，這些都有待于進一步研究。

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