需氧菌與厭氧菌混合感染致糖尿病足一例病原學(xué)檢測

陳麗丹,石玉玲,曾蘭蘭

1 病例簡介

患者,男,44歲,有糖尿病病史,因 “右下肢進(jìn)展性紅腫、潰瘍、流膿、壞死伴疼痛 1月”入院?；颊哂?2009年8月 10日左右勞作中被鐵片刺傷,足跟部出現(xiàn)破潰,逐漸形成潰瘍,右足腫脹明顯,自行在社區(qū)診所清創(chuàng),效果不佳,足跟處膿腫擴(kuò)大,膿液較多,8月底紅腫逐漸向上蔓延,右下肢外側(cè)皮膚可見皺起、水皰、破潰伴有壞死表現(xiàn),散發(fā)較濃重的腥臭味,疼痛加重。9月 2日于外院就診,入院時下肢紅斑腫脹仍未控制,繼續(xù)向上蔓延,皮膚表面出現(xiàn)黑色壞死,足底部潰瘍擠壓后可見大量氣泡溢出,體溫升高,診斷為 “右足外傷并產(chǎn)氣莢膜桿菌感染”,入院后給予 “頭孢他定、左氧氟沙星”抗感染治療,局部疼痛稍有緩解,但病情仍繼續(xù)發(fā)展,9月 16日轉(zhuǎn)入我院。查體發(fā)現(xiàn)右下肢腫脹明顯,右側(cè)足跟處可見一 3.5 cm×3.5 cm的潰瘍,邊界不清,有較多稀薄膿液流出,腥臭味明顯,擠壓后可見大量氣泡溢出。右大腿及小腿可見皮下氣腫,觸之可扣及捻發(fā)音,從足底至右側(cè)腰際部均可觸及.大腿外側(cè)可見大片糜爛,其上有 2～3處約 5 cm×5 cm的黑斑,右下肢觸痛明顯。入院后測餐后血糖為 30.8 mmol/L,給予胰島素靜脈滴注,次日清晨空腹血糖降為 10.0 mmol/L。請骨科、高壓氧科及普外科會診,會診后均考慮為 “氣性壞疽”,建議行手術(shù)治療。檢驗科細(xì)菌室床邊取材,在對傷口進(jìn)行消毒后,將棉簽鉆入傷口取分泌物及時接種于厭氧血平板、普通血平板、皰肉培養(yǎng)基等,同時涂片。并取少許分泌物用于熒光PCR檢測。

2 病原學(xué)檢測方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 普通培養(yǎng)及厭氧培養(yǎng)同時進(jìn)行,對厭氧培養(yǎng)菌進(jìn)行兩次耐氧實驗確證為專性厭氧菌。需氧菌的鑒定采用法國梅里埃 VITEK-2 COMPECT全自動生化鑒定儀;厭氧菌的鑒定采用梅里埃的API20A鑒定條。

2.2 熒光 PCR (1)從臨床標(biāo)本中提取 DNA,制備模板。 (2)探針序列為:5′-[FAM]TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC[TAMRA]-3′, 引物 1序列為:5′-CGCATAACGTTGAAAGATGG-3′, 引物 2序列為:5′-CCTTGGTAGGCCGTTACCC-3′。(3)PCR體系:5 μl緩沖液;1μl dNTPs;引物 1、2各 1μl;0.6μl探針;0.2μl Taq酶及 2 μl細(xì)菌DNA模板,無菌雙蒸水補(bǔ)足體積 25μl。(4)Roche Light Cycler 480全自動熒光定量 PCR擴(kuò)增儀,程序:95℃5 min,95℃ 15 s、55℃20 s、72℃20 s、在 55℃時采集熒光,重復(fù) 40個循環(huán)。陽性對照為產(chǎn)氣莢膜梭菌 ATCC13124;陰性對照為大腸埃希菌 ATCC25922,

3 檢測結(jié)果

3.1 革蘭染色結(jié)果 傷口分泌物涂片鏡檢可見大量革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌及白細(xì)胞。普通血平板培養(yǎng)分離到兩種陽性球菌,厭氧血平板培養(yǎng)可見多種細(xì)菌生長,分離純化并進(jìn)行耐氧實驗 (即同時接種需氧及厭氧血平板)。最終分離到專性厭氧菌兩株,兼性需氧菌兩株,經(jīng)過鑒定厭氧菌為多毛擬桿菌、消化鏈球菌;需氧菌為糞腸球菌和鳥腸球菌。

3.2 綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù),設(shè)定合理的閾值和基線 基線選取 2～6或3～7個循環(huán),閾值線選在陰性擴(kuò)增曲線的上方。儀器自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算出樣本的結(jié)果。若擴(kuò)增曲線顯示有抬高,CT值 ＜36個循環(huán),認(rèn)為標(biāo)本中產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性;若擴(kuò)增曲線無抬高或 CT值≥36個循環(huán),認(rèn)為標(biāo)本中產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性。本患者傷口棉拭子及傷口引流液檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌均為陰性,陽性對照、陰性對照均在控。

4 討論

糖尿病足病理基礎(chǔ)是糖尿病的神經(jīng)病變和血管病變,兩者和感染一起決定了糖尿病足病變的嚴(yán)重程度。而糖尿病足潰瘍的創(chuàng)面中,由于其滲出物中蛋白及糖的含量高,有利于細(xì)菌生長,極易合并感染,是導(dǎo)致壞疽,繼而致殘、致死的重要因素。5%～10%的糖尿病足患者需進(jìn)行截肢手術(shù)[1]。氣性壞疽常由產(chǎn)氣莢膜梭菌等厭氧菌侵襲傷口,導(dǎo)致嚴(yán)重感染,以組織壞死、水腫產(chǎn)氣、全身中毒為特征,氣性壞疽的潛伏期從 8 h至 3周不等,但多為 1～4 d。傷口處皮膚開始為蒼白色,逐漸變成紅色或青銅色,周圍有明顯腫脹,觸診堅硬;局部可出現(xiàn)水皰,水皰液可澄清或為血色;傷口周面可捫及捻發(fā)音,擠壓可有惡臭氣體溢出,并有漿液樣血性分泌物流出。氣性壞疽的病原體分離:取患者的傷口滲出液或水皰液,進(jìn)行革蘭染色,可見大量革蘭陽性桿菌,偶見極少量的白細(xì)胞。若出現(xiàn)大量白細(xì)胞則提示合并其他細(xì)菌感染[2]。

該患者傷口分泌物涂片可見大量白細(xì)胞,并可見大量陽性球菌及陰性桿菌,而未見革蘭陽性桿菌。盡管從臨床癥狀分析多數(shù)醫(yī)生考慮氣性壞疽,但病原學(xué)上并不支持該觀點(diǎn)。首先患者發(fā)病部位由足跟至腰部,發(fā)展時間已超過 1個月,若為產(chǎn)氣莢膜梭菌,其繁殖速度迅猛,若條件適宜(低氧化還原電勢或低酸堿度)感染可在1 d內(nèi)蔓延至患者全身,引起休克甚至死亡。其次熒光定量 PCR靈敏度極高,只要標(biāo)本中細(xì)菌含量超過 10 CFU均可被檢出,而本次檢測結(jié)果為產(chǎn)氣莢膜梭菌陰性,提示標(biāo)本中不含有該菌。從患者傷口分離到的厭氧菌為多毛擬桿菌、消化鏈球菌;需氧菌為糞腸球菌、鳥腸球菌,提示該患者的足部潰爛是由多種需氧及厭氧菌混合感染所致。及時的抗菌治療和聯(lián)合用藥可減少截肢發(fā)生的可能性和病死率[3]。該患者在接受高壓氧及抗菌治療后已出院,在之后的隨訪中患者的病情有所好轉(zhuǎn)。

本病例提示多種細(xì)菌感染特別是混合厭氧菌感染時可同樣表現(xiàn)出皮下腫脹、腥臭味及捻發(fā)音。因而在臨床懷疑氣性壞疽時應(yīng)行快速涂片查找陽性桿菌或熒光定量PCR快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌,確實有病原學(xué)證據(jù)時再行相應(yīng)處理,避免因誤診導(dǎo)致患者截肢。

1 胡仁明,朱禧明 .糖尿病 [M]//陳灝珠 .實用內(nèi)科學(xué) .12版 .北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:1015-1026.

2 陳軍,盧洪洲 .氣性壞疽的診斷與治療[J].診斷學(xué)理論與實踐,2009,8(1):111-113.

3 蔡健 .糖尿病足感染的細(xì)菌學(xué)與藥敏分析[J].疑難病雜志,2006,5(5):368.