多聚磷酸鈉/殼聚糖多孔微載體的制備研究

周 燕 劉寶林* 韓寶三 楊曉昀 王 欣 楊 波 彭承宏

1)(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 生物熱科學研究所，上海 200093)

2)(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院普外科、乳腺疾病診治中心，上海 200025)

3)(上海消化外科研究所 上海 200025)

引言

借鑒人工腎技術發(fā)展起來的人工肝(artificial liver，AL)，為肝功能衰竭的患者等待肝移植或自身肝再生爭取了時間、創(chuàng)造了條件，為肝功能衰竭患者的治療提供了新的希望。AL研究的近50年歷史表明，只有以肝細胞為主要材料的生物人工肝(bioartificial liver，BAL)才具備真正意義上的“肝臟”功能，為肝功能衰竭病人提供可靠的人工肝支持。BAL中的肝細胞必須達到兩個標準：一是要求一定數(shù)量的肝細胞，至少為109～1010個;二是培養(yǎng)的肝細胞必須具有肝臟的特異性功能。這就需要一種能實現(xiàn)肝細胞高密度、高活性培養(yǎng)的方法，而目前已發(fā)表文獻中提及的肝細胞培養(yǎng)方法還難以實現(xiàn)這個目標。肝細胞的微載體(microcarrier)培養(yǎng)法的優(yōu)點是有較大的比表面積，可以明顯提高肝細胞的培養(yǎng)密度。

細胞微載體通常有兩種形式：實心微球[1]和微膠囊[2]。實心微球的表面積有限，細胞只能黏附在其表面;而對于微膠囊，細胞只能包裹在其里面。兩種情況均不利于細胞的大量繁殖和生長，而表面開孔、內(nèi)部具有多孔結(jié)構(gòu)的微載體則較好地解決了這一問題。多孔微載體的表面積大大增加，將有利于黏附更多的細胞，開孔結(jié)構(gòu)也有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和細胞的生長。

在國外，有學者開展了多孔微載體培養(yǎng)肝細胞的研究，但尚處于起始階段，代表性的是瑞典Pharmacia Biotech公司的Cytopore系列。在國內(nèi)，近年有學者用膠原、殼聚糖等材料結(jié)合材料表面化學接枝改性技術從事實心微載體的研究，效果不理想。目前，國內(nèi)尚未見用多孔微載體進行肝細胞的三維立體培養(yǎng)并成功運用于BAL研究的報道。

殼聚糖分子中含有大量的—NH2[3]，酸溶液中被質(zhì)子化，形成—NH3+而溶解。多聚磷酸鈉由于其分子上的多個負電基團可以與殼聚糖分子中的大量—NH+3形成分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)[4-5]，從而使殼聚糖分子沉析出來。殼聚糖和多聚磷酸鹽的結(jié)構(gòu)示意圖分別見圖1和圖2。

圖1 圖1 殼聚糖的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of chitosan

圖2 多聚磷酸鹽的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of tripolyphosphate

筆者通過研究高聚物多聚磷酸鈉與殼聚糖之間通過靜電交互作用形成聚電解質(zhì)復合物(PEC)，并與戊二醛和NaOH進行沉積交聯(lián)作比較，同時結(jié)合冷凍干燥方法以，制備出機械強度和生物相容性均符合要求的多孔微載體。

1 材料和方法

1.1 材料

高壓脈沖微膠囊成型裝置(上海理工大學);微機控制降溫儀(上海理工大學);Virtis凍干機(Virtis公司，美國);掃描電鏡 SEM(FEI公司，美國);光學顯微鏡(Nikon公司，日本);SHA-C水浴恒溫振蕩器;多聚磷酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，中國);殼聚糖(脫乙酰度≥90%，國藥集團化學試劑有限公司，中國);其他試劑均選用分析純。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖溶液配制

分別稱取殼聚糖3 g和2 g，并溶解于100 mL、1%的稀醋酸中;將殼聚糖溶液置于37℃的水浴恒溫振蕩器中，持續(xù)振蕩至其完全溶解，靜置一段時間使殼聚糖中氣泡消失，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高壓脈沖微膠囊成型裝置制備微球[6-9]

利用高壓脈沖微膠囊成型裝置(見圖3)制備微球，根據(jù)預實驗的結(jié)果，確定高壓脈沖微膠囊成型裝置參數(shù)(見表1)，微球制備單因素試驗見表2。

圖3 高壓脈沖微膠囊成型裝置原理(1－多聚磷酸鈉溶液;2－注射器;3－殼聚糖酸溶液;4－輸液泵;5－鐵架臺;6－負極接線;7－正極接線;8－高壓發(fā)生器)Fig.3 Principle of preparation of microsphere by high voltage field(1 sodium tripolyphosphate;2 injector;3 chitosan solution;4 infusion pump;5 iron support;6 negative terminal;7 positive terminal;8 high-voltage generator)

表1 高壓脈沖微膠囊成型裝置參數(shù)Tab.1 Parameters of the microsphere forming apparatus by high voltage field

表2 微球制備單因素實驗表Tab.2 Single factor experiment for the preparation of microsphere

用7#注射器抽取適量的殼聚糖溶液，輸液泵以一定速度向下推壓，結(jié)合電場力作用，殼聚糖溶液通過7#平針頭成滴地滴入燒杯中的多聚磷酸鈉溶液，液滴固化交聯(lián)形成多聚磷酸鈉/殼聚糖微球。靜置微球懸液30 min。SEM觀察，微球出現(xiàn)皺縮塌陷現(xiàn)象(見圖4)，顯示此時的微球為空心微球。

圖4 多聚磷酸鈉/殼聚糖空心微球Fig.4 The SEM image of tripolyphosphate/chitosan hollow microsphere

根據(jù)表2，分別滴加一定量5%的NaOH溶液和1%的戊二醛溶液交聯(lián)微球。48 h后，取蒸餾水清洗微球數(shù)遍，至無殘留戊二醛。處理后，將微球置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 冷凍干燥制備多孔微載體

利用微機控制降溫儀，以恒定降溫速率1℃/min，使微球從室溫降至不同的預凍溫度[10](-15、-20、-25、-30、-35℃)，并恒溫 2 h使其完全凍結(jié)。凍結(jié)后微球轉(zhuǎn)至已預冷至相應溫度的凍干機中進行一次干燥，該過程中控制凍干箱的真空度為10～30 Pa，以除去微球中的自由水。二次干燥時，設置擱板溫度為20℃，除去微球中的結(jié)合水。凍干曲線見圖5。

圖5 冷凍干燥過程中凍干曲線Fig.5 Lyophilization curves of the freeze drying process

1.2.4 多孔微載體的表征

1.2.4.1 掃描電鏡制樣及分析

取10顆微載體，真空噴金后SEM觀察。選擇合適的放大倍數(shù)，觀察微載體粒度分布和內(nèi)孔特征。

1.2.4.2 微載體的吸水性

稱取干態(tài)時微載體質(zhì)量W1。室溫下，將其浸泡在蒸餾水中12 h，取出后用濾紙吸干表面的水分，稱重為W2，則微載體的吸水率為

1.2.4.3 孔隙率[11]

采用液體置換方法，測定微載體的孔隙率。這里選無水乙醇作為置換液體。將一定量干態(tài)微載體浸泡在V1體積無水乙醇中5 min，之后刻度管顯示為V2;取出微載體后，管中顯示為 V3。所以微載體的體積V=V2-V3，孔隙率為

2 結(jié)果

2.1 高壓脈沖微膠囊成型裝置的參數(shù)設置

實驗表明，該裝置的電壓、推進速度、液面距、脈寬、頻率以及殼聚糖和多聚磷酸鈉的濃度，均會對微載體的成型產(chǎn)生影響。

根據(jù)前人的經(jīng)驗及單因素試驗結(jié)果，高壓脈沖微膠囊成型裝置的參數(shù)設置如下：電壓55 kV，推進速度90 mm/h，液面距25 mm，脈寬6，頻率90 Hz。

隨著殼聚糖和多聚磷酸鈉濃度的增加，微球的的均勻性增加，空心度減小。戊二醛和NaOH促使微球加快實心化。48 h后，殼聚糖與0.1 mM多聚磷酸鈉靜電作用所得微球，經(jīng)兩種交聯(lián)劑沉積后，微球外層會破裂，滲出中間物(見圖6)。而殼聚糖與0.08 mM多聚磷酸鈉靜電作用所得微球，戊二醛交聯(lián)沉積后微球顏色泛黃，但表面光潔度高，沉積結(jié)實穩(wěn)定;經(jīng)NaOH沉積后，微球顏色無明顯變化，但沉積耗時長，且沉積難以完全徹底，見圖7。

2.2 冷凍干燥過程的參數(shù)設置

實驗結(jié)果表明，當預凍速度為1℃/min、預凍溫度在-35℃時，制得的微載體效果最好，見圖8中的(a)和(b)，微載體的孔隙率超過80%，內(nèi)部孔洞之間相互連通，但微球的表面孔隙不明顯。同時可以看出，經(jīng)NaOH交聯(lián)沉積后的微球(見圖8(a))部分表面會出現(xiàn)孔隙，而經(jīng)戊二醛沉積的微球(見圖8中的(c)和(d))表面則沒有任何孔隙存在。從圖8(c)觀察可知：冷凍干燥后的微載體粒徑較剛制出的微球粒徑小，這是因為冷凍干燥過程引起微球有一定的收縮。但是，這種尺寸范圍的微載體仍適宜于生物人工肝的應用。

3 討論

3.1 影響多孔微載體成型和粒徑的因素分析

圖6 0.1 mM多聚磷酸鈉靜電作用微球的顯微鏡照片。(a)NaOH沉積;(b)戊二醛沉積Fig.6 Microscope images of 0.1 mM sodium tripolyphosphate microspheres.(a)NaOH deposition;(b)GA deposition

圖7 0.08 mM多聚磷酸鈉靜電作用微球的顯微鏡照片。(a)NaOH沉積;(b)戊二醛沉積Fig.7 Microscope images of 0.08 mM sodium tripolyphosphate microspheres.(a)NaOH deposition;(b)GA deposition

電壓升高，微球的平均粒徑快速減小。輸液泵的推進速度提高，殼聚糖溶液向針尖的流速增大，形成微球的速度增加，微球的平均粒徑增大且均勻性好。液面距增加，液滴所受的電場力減小，微球粒徑逐漸增大。脈寬增加，微球粒徑增大。頻率與粒徑相關性不高，但影響粒徑的均勻性。

3.2 影響多孔微載體內(nèi)部孔徑和孔隙率及吸水性的因素

從微載體內(nèi)部形成孔洞結(jié)構(gòu)的機理來看，微球內(nèi)部形成的冰晶越大，最后形成的孔徑也就越大。預凍過程不僅是為了保護物質(zhì)的主要性能不變，更重要的是使凍結(jié)后的樣品有合理的結(jié)構(gòu)，以利于水分的升華。預凍效果主要由3個因素決定：預凍速度、預凍溫度和時間。預凍速度較大時，形成的冰晶細小且數(shù)量較多。升華之后留下的孔道小，水蒸氣逸出的阻力大，升華速率減慢;但凍干品外觀質(zhì)量好、比表面積大，易于復水。預凍溫度過低，會使材料出現(xiàn)玻璃化，不符合形成多孔微載體的要求。

微載體表面的孔隙不明顯，原因可能是殼聚糖與多聚磷酸鈉反應過度，且表面孔隙可能是NaOH與殼聚糖反應的結(jié)果。這還有待進一步研究驗證，并考慮在后期實驗中加入致孔劑，以使微載體表面和內(nèi)部均有孔隙。

微載體的吸水性隨其孔隙率提高而加強。吸水性好的微載體有很強的保水性，這樣的微載體可以防止體液和營養(yǎng)成分的流失，有利于細胞的生長。

4 結(jié)論

采用高壓靜電技術和冷凍干燥技術制備多聚磷酸鈉/殼聚糖微載體，改善了傳統(tǒng)乳化法制備微載體時粒徑不可控、圓整度不好等缺點，且操作方便。應用冷凍干燥技術，能獲得內(nèi)部有孔洞且孔徑均勻的微載體，但微載體的連通性沒有達到預期要求，微載體的外層有硬殼，且微載體的機械強度有待進一步增強。后期的工作重點將放在如何制備表面和內(nèi)部均有孔徑的微載體，同時需進一步提高微載體的機械強度。只有這樣，制備的微載體方能適合細胞的生長繁殖和組織再生。

圖8 微載體掃描電鏡照片。(a)和(b)NaOH沉積微載體的外表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu);(c)和(d)戊二醛沉積微載體外表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.8 SEM images of microcarriers.(a)and(b)the outer surface structure and internal structure of the microcarrier by NaOH deposition;(c)and(d)the outer surface structure and internal structure of the microcarrier by GA deposition

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