基于聲表面波器件的仿生嗅覺(jué)受體傳感器的研究

杜立萍吳春生王 鏑王 樂(lè)劉清君趙魯杭王 平*

1)(浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027)2)(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與遺傳學(xué)系，杭州 310058)

基于聲表面波器件的仿生嗅覺(jué)受體傳感器的研究

杜立萍1吳春生1王 鏑1王 樂(lè)1劉清君1趙魯杭2王 平1*

1)(浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027)2)(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與遺傳學(xué)系，杭州 310058)

嗅覺(jué)受體可以與氣味分子發(fā)生特異性的相互作用，這一機(jī)理不僅在生物嗅覺(jué)系統(tǒng)分辨和識(shí)別氣味的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而且也為解決傳統(tǒng)嗅覺(jué)傳感器特異性低的問(wèn)題提供新的途徑。從仿生設(shè)計(jì)角度，利用嗅覺(jué)受體對(duì)其配體特異性識(shí)別的機(jī)理，提高嗅覺(jué)傳感器的特異性。以嗅覺(jué)受體作為敏感元件，聲表面波器件作為二級(jí)傳感器，構(gòu)建一種可用于特異性氣味檢測(cè)的新型嗅覺(jué)受體傳感器。選擇秀麗線蟲嗅覺(jué)受體ODR-10作為生物識(shí)別元件，通過(guò)基因工程的方法，將其表達(dá)在人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7細(xì)胞質(zhì)膜上，提取含有 ODR-10的細(xì)胞質(zhì)膜組分，將其涂覆在聲表面波器件的敏感區(qū)域。結(jié)果表明，ODR-10可以有效地表達(dá)于MCF-7的細(xì)胞質(zhì)膜上，用這種異源表達(dá)的ODR-10構(gòu)建的仿生嗅覺(jué)傳感器對(duì)ODR-10的配體丁二酮具有很高的靈敏度，并具有很好的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，這種基于嗅覺(jué)受體的仿生嗅覺(jué)傳感器不僅適用于特異性氣味檢測(cè)，也適用于篩選特異性的嗅覺(jué)受體-配體對(duì)，將進(jìn)一步推動(dòng)嗅覺(jué)傳導(dǎo)機(jī)理研究的進(jìn)展。

嗅覺(jué)傳感器;生物傳感器;嗅覺(jué)受體;氣味檢測(cè);聲表面波

Abstract:High specific interactions between olfactory receptors and odorant molecules play an important role in the discrimination and recognition of various odorants in biological olfactory systems.This mechanism may also provide novel approaches for improving the specificity of conventional gas sensors.Inspired by the biomimic design，this study attempted to improve the specificity of gas sensor by using olfactory receptors as sensitive elements.The novel olfactory biosensor employed the surface acoustic wave(SAW)device as the secondary sensor to detect specific gas molecules.An olfactory receptor protein of C.elegans，ODR-10，was heterologously expressed on the membrane of human breast cancer cell line MCF-7.Then the crude membrane extracts of MCF-7 containing ODR-10 was coated on the sensitive region of SAW.The interactions between ODR-10 and various odorant molecules were monitored by recording the frequency shift of SAW.The experimental results indicated that ODR-10 could be expressed on the membrane of MCF-7 and gas sensors with ODR-10 showed specific responses to diacetyl(2，3-butanedione)，which is known as a natural ligand for ODR-10 receptor.All the results demonstrated that the specificity of gas sensor could be improved by using olfactory receptor proteins.It provides a novel method for improving gas sensing technologies as well as for screening specific olfactory receptor-ligand pairs，which can consequently advance the progress of research on olfactory transduction mechanisms.

Key words:olfactory sensors;biosensor;olfactory receptor;gas detection;surface acoustic wave

引言

氣體檢測(cè)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品安全、醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用，促進(jìn)了氣敏傳感器以及電子鼻檢測(cè)系統(tǒng)的快速發(fā)展，尤其是電子鼻系統(tǒng)已經(jīng)得到了系統(tǒng)的研究和廣泛的應(yīng)用［1］。作為氣體檢測(cè)的最基本元件，當(dāng)前大部分氣敏傳感器都是基于傳感器表面涂覆特殊的材料來(lái)進(jìn)行氣體檢測(cè)，如金屬氧化物［2］、導(dǎo)電聚合物［3］、超分子化合物、無(wú)機(jī)物膜材料、分子液晶等，這些敏感膜材料普遍存在的問(wèn)題是特異性差。1998年，Gopel首次提出生物電子鼻的概念，將生物材料直接作為氣體檢測(cè)的敏感材料，模擬天然生物嗅覺(jué)系統(tǒng)構(gòu)建檢測(cè)氣體的電子鼻系統(tǒng)［4-6］。

生物的嗅覺(jué)系統(tǒng)具有高度的靈敏度和特異性，這得益于生物進(jìn)化過(guò)程中形成的完備的傳感基礎(chǔ)和機(jī)制。2004年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者Buck和Axel克隆出嗅覺(jué)受體基因超家族，為嗅覺(jué)產(chǎn)生機(jī)理的研究做出了巨大貢獻(xiàn)［7］。嗅覺(jué)信號(hào)產(chǎn)生的第一級(jí)在嗅黏膜上，那里存在大量的嗅覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞，每個(gè)嗅覺(jué)神經(jīng)元上都表達(dá)有唯一的嗅覺(jué)受體蛋白(olfactory receptor proteins，ORPs)，而每種嗅覺(jué)受體蛋白只能選擇性地與特定的一種或幾種配體分子結(jié)合，之后偶聯(lián)細(xì)胞膜上的G蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生，相應(yīng)離子通道的開放引起嗅覺(jué)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，這樣氣味化學(xué)信號(hào)被轉(zhuǎn)換為電信號(hào)［8］。隨后電信號(hào)被傳導(dǎo)至上級(jí)的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的信息編碼與處理，最終形成嗅覺(jué)。嗅覺(jué)受體與氣味分子的特異性結(jié)合是嗅覺(jué)系統(tǒng)特異性的重要生物基礎(chǔ)，因而具有重要的意義。許多學(xué)者探索利用生物材料天然的敏感性來(lái)構(gòu)建用于氣體檢測(cè)的電子鼻系統(tǒng)，如嗅神經(jīng)元細(xì)胞［9］、表達(dá)有嗅覺(jué)受體的酵母［10］、嗅覺(jué)受體［11-12］等，取得了一定的成果。

本研究構(gòu)建特異性的仿生氣敏傳感器，模擬生物嗅覺(jué)系統(tǒng)特異性識(shí)別氣體的過(guò)程，探索將嗅覺(jué)受體與氣味分子特異性結(jié)合的特性直接應(yīng)用于新型的氣敏傳感器的構(gòu)建［13］。選擇線蟲的嗅覺(jué)受體ODR-10作為傳感器的生物識(shí)別元件(已知其天然配體是丁二酮)，通過(guò)基因工程的方法獲得這種受體蛋白，經(jīng)過(guò)生物方法的鑒定后，將其與聲表面波傳感器耦合，實(shí)現(xiàn)氣體的檢測(cè)與分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料

ODR-10 基因質(zhì)粒 pBluescript SK-/odr-10，由美國(guó)洛克菲勒大學(xué) Bargmann教授提供;MCF-7細(xì)胞系;PCR和 RT-PCR引物，由 TaKaRa公司合成;dNTP及逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)于TaKaRa公司;Trizol，購(gòu)于南京凱基生物;激光共聚焦顯微鏡;聲表面波器件及檢測(cè)系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

首先通過(guò) PCR的方法從質(zhì)粒 pBluescript SK-/odr-10 中獲得 odr-10 的基因序列，其中前向引物 5′-GAGTTGGAATTCATGTCGGGAGAATTGTGG-3′，反向引物為5′-CAGTAAGGATCCCGCGTCGGAACTT GAGACAAATT-3′。信號(hào)肽基因rho-tag的序列從NCBI中查得，由 TaKaRa公司合成，用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ，將其插入pFLAG-CMV-3表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，然后將線蟲嗅覺(jué)受體基因序列 odr-10 插入 pFLAG-CMV-3/rho-tag 的 EcoR I和BamH I之間，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10。構(gòu)建成功后，對(duì)質(zhì)粒序列進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.2 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在添加了10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的 DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染之前，細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中并孵化一天。轉(zhuǎn)染試劑為含有 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10的lipofectamin 2000試劑。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用G418(800 mg/L)進(jìn)行穩(wěn)定株的篩選。

2.3 嗅覺(jué)受體的生物鑒定

2.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)

通過(guò)使用連接有 FITC的 ANTI-FLAG M2單克隆抗體，檢測(cè)融合蛋白FLAG的表達(dá)，表征嗅覺(jué)受體ODR-10在細(xì)胞膜上的定位情況。為進(jìn)行熒光顯微鏡的觀察，先將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種在6孔板中，再用甲醇:丙酮(1∶1)混合液固定1 min，室溫下將抗體孵育1 h。然后沖洗細(xì)胞，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，吸收波長(zhǎng)492 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。

2.3.2 RT-PCR

使用RT-PCR的方法，實(shí)現(xiàn)在 mRNA水平鑒定嗅覺(jué)受體的表達(dá)。使用 Trizol提取總 RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以隨機(jī)六聚引物PrimeScriptTMRTase(200 U/μL)為逆轉(zhuǎn)錄酶，在42℃反應(yīng)1 h。然后，在50 μL反應(yīng)體系中加入2 μg的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，上 游引物序 列為5′-GTCGCAGGATCCTCGAGATGAACGGGACCGAGGGC-3′，下游引物序 列 為5′-CAGTAAGGATCCCGCGTCGGAACTTGA GACAAATT-3′:首先 94℃ 預(yù)變性 5 min，再以 94℃× 1 min、55℃× 50 s、72℃× 80 s、40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后72℃×5 min。PCR產(chǎn)物在含有 ethidium bromide的2%瓊脂糖凝膠中電泳，通過(guò)紫外成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。

2.4 嗅覺(jué)受體蛋白的粗提取

經(jīng)過(guò)篩選的穩(wěn)定株細(xì)胞用PBS清洗后從培養(yǎng)瓶中收獲。收獲的細(xì)胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16 000 g離心40 min。浮在表面的是細(xì)胞溶質(zhì)部分，小球是膜部分。浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和5倍的尿素標(biāo)本緩沖液混合。小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細(xì)胞裂解液在冰凍條件下溶解30 min。然后，將5倍的尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有表達(dá)于膜上的嗅覺(jué)受體蛋白ODR-10。

2.5 傳感器的構(gòu)建與檢測(cè)

采用雙通道延遲線型聲表面波器件作為換能器，通過(guò)檢測(cè)嗅覺(jué)受體與氣體結(jié)合過(guò)程中的質(zhì)量變化情況，實(shí)現(xiàn)氣體的特異性檢測(cè)。聲表面波器件采用旋轉(zhuǎn)128°Y切 X傳播的 LiNbO3基片。其中，一個(gè)通道作為參比通道，中心頻率為120.1 MHz;另一個(gè)通道作為檢測(cè)通道，中心頻率為119.6 MHz。傳感器帶寬為0.9 MHz，Q值為133.5，傳感器結(jié)構(gòu)如圖1所示。在雙通道SAW延遲線振蕩器結(jié)構(gòu)中，一個(gè)通道的SAW傳播路徑被氣敏薄膜所覆蓋而用于測(cè)量，另一通道未覆蓋薄膜而用于參考。兩個(gè)振蕩器的頻率經(jīng)混頻取差額輸出，以實(shí)現(xiàn)對(duì)共模干擾自補(bǔ)償。

駱塞夫先生《向陽(yáng)與背陰》由樹講到人，背陰者生活艱辛，然，不甘平庸者以百倍于他人的努力，最終成材、成才；向陽(yáng)者生活條件好，若借此機(jī)會(huì)養(yǎng)尊處優(yōu)不肯努力，最終也難成棟梁之才。揭示的就是有利因素和不利因素在一定的條件下，都向各自相反的方向轉(zhuǎn)化的辯證關(guān)系。

在實(shí)驗(yàn)中，首先將含有 ODR-10受體的細(xì)胞膜蛋白采用滴涂法沉積于聲表面波器件的敏感區(qū)域，待膜徹底干燥后進(jìn)行檢測(cè)。受體蛋白對(duì)氣體的特異性吸附引起聲表面波器件敏感區(qū)域的質(zhì)量改變，輸出的頻率改變與質(zhì)量變化成正比。聲表面波器件的輸出頻率變化與敏感區(qū)域的質(zhì)量變化之間的關(guān)系為

圖1 雙通道延遲線型聲表面波傳感器結(jié)構(gòu)Fig.1 Schematic diagram of dual-channel delay line surface acoustic wave sensor

式中，Δf是檢測(cè)前后輸出頻率的變化值，Δm是敏感區(qū)域的質(zhì)量變化，f0是聲表面波器件檢測(cè)前的頻率，A為敏感區(qū)的面積，k是聲表面波器件敏感材料的基質(zhì)系數(shù)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中涂覆的敏感膜不同，將實(shí)驗(yàn)分為3組:一為含嗅覺(jué)受體膜蛋白的傳感器組，敏感膜使用含有ODR-10受體的細(xì)胞膜蛋白;二為不含嗅覺(jué)受體膜蛋白的傳感器組:敏感膜為不含有 ODR-10受體的細(xì)胞膜蛋白;三為無(wú)任何膜蛋白的傳感器組，聲表面波敏感區(qū)不涂覆任何敏感膜材料。這三組傳感器分別對(duì)空氣、乙醇、丁二酮3種氣體進(jìn)行測(cè)定，以檢測(cè)其響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中每種氣體各2 mL，且要求保證氣體具有恒定的流速。

此外，為確定含有嗅覺(jué)受體膜蛋白的傳感器對(duì)ODR-10受體的天然配體是否有特異性響應(yīng)，以幾種與丁二酮結(jié)構(gòu)相似的氣體作為被測(cè)氣體，分別是戊二酮、丁醇、乙醇，檢測(cè)傳感器的輸出響應(yīng)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

ODR-10表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示，其中引導(dǎo)肽是rho-tag，用于引導(dǎo)表達(dá)的 ODR-10定位到細(xì)胞的質(zhì)膜上;FLAG蛋白用于免疫標(biāo)記鑒定，以觀察ODR-10是否表達(dá)在細(xì)胞的質(zhì)膜上。構(gòu)建好的質(zhì)粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 經(jīng)酶切后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示;再經(jīng)測(cè)序鑒定，表明所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒正確。

3.2 嗅覺(jué)受體蛋白ODR-10在MCF-7細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)

為了進(jìn)一步鑒定嗅覺(jué)受體蛋白在異源細(xì)胞系統(tǒng)MCF-7的表達(dá)情況，采用 RT-PCR的方法測(cè)定受體蛋白ODR-10在 mRNA水平上的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。在1 kb位置上，可以看見(jiàn)一條特別明亮的條帶，與理論位置相符，證明了嗅覺(jué)受體蛋白在mRNA水平上有顯著的表達(dá)。

圖2 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10質(zhì)粒結(jié)構(gòu)Fig.2 Schematic diagram of the constructed plasmid pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10

圖3 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10酶切后電泳鑒定結(jié)果。M，DNA標(biāo)記;泳道1，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ酶切后的質(zhì)粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10，泳道 2，經(jīng)ECoRⅠ和BamHⅠ酶切后的質(zhì)粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10，泳道3:經(jīng) HindⅢ和 BamH I酶切后的質(zhì)粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10;泳道 4，未經(jīng)酶切的質(zhì)粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10Fig.3 Gel electrophoresis of pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by restricted enzymes.Lane M:DNA size marker;Lane 1:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by HindⅢand EcoRI;Lane 2:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by ECoRI and BamHI;Lane 3:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by HindⅢand BamHI;Lane 4:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 was not digested

3.3 聲表面波傳感器的響應(yīng)

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果。(a)熒光視野;(b)可見(jiàn)光視野Fig.4 The result of the immunocytochemistry.(a)florenscence field;(b)optical field

圖5 RT-PCR結(jié)果Fig.5 The result of RT-PCR

實(shí)驗(yàn)中用3組聲表面波傳感器對(duì)空氣、乙醇、丁二酮3種氣體進(jìn)行測(cè)試，其中乙醇和空氣是對(duì)照性氣體，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理后的結(jié)果如圖6所示。Δf=f′-f0，其中f0是每組傳感器的靜態(tài)頻率輸出值，f′測(cè)試氣體以一定速度流經(jīng)傳感器表面時(shí)引起的頻率輸出值，故Δf是傳感器對(duì)一定流速的測(cè)試氣體的響應(yīng)值。Δf′傳感器對(duì)一定流速的空氣的響應(yīng)值，用Δf′對(duì) Δf做數(shù)據(jù)歸一化處理(即 Δf/Δf′)，以排除氣流干擾等環(huán)境因素引起的傳感器非特異性響應(yīng)。

圖6 傳感器輸出響應(yīng)Fig.6 The output of the sensor

1)在含有嗅覺(jué)受體膜蛋白的傳感器組中，傳感器對(duì)丁二酮的響應(yīng)顯著高于對(duì)乙醇的響應(yīng)，P=0.009 177(P＜0.01，n=5)，二者具有顯著性差異。

2)對(duì)于丁二酮的響應(yīng)，含 ODR-10嗅覺(jué)受體膜蛋白傳感器的響應(yīng)顯著高于不含ODR-10受體膜蛋白的傳感器組，P=0.000 454 7(p＜0.001，n=5)，具有極顯著差異;同時(shí)也極顯著高于沒(méi)有敏感膜的傳感器組的響應(yīng)，P=0.000 146(P＜0.001，n=5)。

綜合1)和2)可知，基于嗅覺(jué)受體的聲表面波傳感器對(duì)丁二酮的特異性響應(yīng)是由于嗅覺(jué)受體ODR-10的存在引起的。

3)對(duì)于乙醇的響應(yīng)，兩組涂有膜蛋白的傳感器組無(wú)顯著性差異，P=0.331 503(P＞0.05，n=5);而與沒(méi)有敏感膜的傳感器組存在顯著性差異，P=0.002 195(P＜0.01，n=5)。這說(shuō)明兩組涂有膜蛋白的傳感器對(duì)乙醇的響應(yīng)是其他膜蛋白成分對(duì)乙醇的非特異性吸附作用引起的。

4)在無(wú)嗅覺(jué)受體的膜蛋白組的實(shí)驗(yàn)中，傳感器對(duì)乙醇的響應(yīng)極顯著地高于對(duì)丁二酮的響應(yīng)，P=0.000 799 3(P＜0.001，n=7);而在沒(méi)有敏感膜的一組中，傳感器對(duì)乙醇和丁二酮兩種氣體的響應(yīng)相當(dāng)，并無(wú)顯著性差異 P=0.261 622(P＞0.05，n=5)。這說(shuō)明，膜對(duì)丁二酮也有一些非特異性吸附作用，但是弱于對(duì)乙醇的非特異性吸附。

以上結(jié)果說(shuō)明，異源表達(dá)的嗅覺(jué)受體蛋白ODR-10保持了天然嗅覺(jué)受體蛋白具有的對(duì)其配體丁二酮的特異識(shí)別能力，并且可以作為敏感元件與二級(jí)傳感器結(jié)合，構(gòu)成氣敏生物傳感器。

以這種基于嗅覺(jué)受體蛋白的聲表面波傳感器為檢測(cè)元件，對(duì)丁二酮、戊二酮、丁醇、乙醇4種氣體分別進(jìn)行檢測(cè)，其中控制實(shí)驗(yàn)條件相同，響應(yīng)的結(jié)果如圖7所示。可以看出，此傳感器對(duì)與丁二酮分子結(jié)構(gòu)略有差別的幾種氣體沒(méi)有特異性的響應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了嗅覺(jué)受體與二級(jí)敏感元件結(jié)合作為氣敏生物傳感器的可行性。

圖7 基于嗅覺(jué)受體的聲表面波氣體傳感器對(duì)氣體的響應(yīng)Fig.7 The responses of the receptor-based gas sensor to several gases

4 討論與結(jié)論

傳感器特異性的檢測(cè)能力取決于特殊生物敏感材料的選取，然而獲得具有生物活性的嗅覺(jué)受體蛋白的工作是比較困難和復(fù)雜的，這成為仿生嗅覺(jué)傳感器研制中的關(guān)鍵。因此，尋找簡(jiǎn)單有效的方法制備嗅覺(jué)受體蛋白具有重要的意義。除本研究所敘述的方法外，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是一種更為方便快捷的蛋白制備手段［14］，它是在體外以外源的mRNA或DNA為模板，在細(xì)胞抽提物的酶系中合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)相比，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)簡(jiǎn)便快速、獲得的蛋白質(zhì)純度較高等。因而，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)能夠?yàn)榛谛嵊X(jué)受體的生物傳感器研制提供純度較高的嗅覺(jué)受體，從而可有效提高傳感器的特異性及靈敏度。此外，嗅覺(jué)受體在二級(jí)傳感器表面上的有效固定也對(duì)傳感器的性能有重要影響，因而尋找更有效的方法將受體蛋白固定在傳感器表面是十分重要的，如采用共價(jià)連接、交聯(lián)連接等。

基于嗅覺(jué)受體對(duì)氣味分子的特異性識(shí)別機(jī)理，筆者以異源表達(dá)的嗅覺(jué)受體蛋白作為敏感元件，以聲表面波器件作為二級(jí)傳感器，構(gòu)建了一種新型嗅覺(jué)傳感器，并證實(shí)了應(yīng)用嗅覺(jué)受體蛋白提高氣味傳感器特異性的方法，同時(shí)也初步探索了使用異源表達(dá)的嗅覺(jué)受體作為生物敏感元件構(gòu)建生物傳感器的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該方法獲得的嗅覺(jué)受體能夠特異性地識(shí)別其天然配體，這為基于受體的仿生嗅覺(jué)傳感器的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也能夠?yàn)榉律娮颖堑陌l(fā)展提出一種新的思路，并可能在臨床上得到應(yīng)用，如用于肺癌患者呼出氣體的診斷分析。此外，這種基于嗅覺(jué)受體的氣體傳感器還可能用于嗅覺(jué)受體-配體對(duì)的研究，作為一種篩選工具來(lái)篩選某些受體對(duì)應(yīng)的配體，為嗅覺(jué)機(jī)理的研究提供一種新的研究手段。

［1］Wilson AD，Baietto M.Applications and advances in electronicnose technologies［J］.Sensors，2009，9(7):5099-5148.

［2］Eranna G，Joshi BC，Runthala DP，et al.Oxide materials for development of integrated gas sensors-A comprehensive review［J］.Critical Reviews in Solid State and Materials Sciences，2004，29(3-4):111-188.

［3］Bai Hua，Shi Gaoquan.Gas sensors based on conducting polymers［J］.Sensors，2007，7(3):267-307.

［4］Gopel W，Ziegler C，Breer H，et al.Bioelectronic noses:a status report-Part 1［J］.Biosensors ＆ Bioelectronics，1998，13(3-4):479-493.

［5］Ziegler C，Gopel W，Hammerle H，et al.Bioelectronic noses:A status report.Part II［J］.Biosensors ＆ Bioelectronics，1998，13(5):539-571.

［6］Gopel W.Chemical imaging:I.Concepts and visions for electronic and bioelectronic noses［J］.Sensors and Actuators BChemical，1998，52(1-2):125-142.

［7］Buck L，Axel R.A novel multigene family may encode odorant receptors-a molecular-basis for odor recognition ［J］.Cell，1991，65(1):175-187.

［8］Spehr M，Munger SD.Olfactory receptors:G protein-coupled receptors and beyond［J］.Journal of Neurochemistry，2009，109(6):1570-1583.

［9］Liu Qingjun，Cai Hua，Li Yan，et al.Olfactory cell-based biosensor:A first step towards a neurochip of bioelectronic nose［J］.Biosensors＆ Bioelectronics，2006，22(2):318-322.

［10］Radhika V，Proikas-Cezanne T，Jayaraman M，et al.Chemical sensing of DNT by engineered olfactory yeast strain［J］.Nature Chemical Biology，2007，3(6):325-330.

［11］Ko HJ，Park TH.Piezoelectric olfactory biosensor:ligand specificity and dose-dependence of an olfactory receptor expressed in a heterologous cell system［J］.Biosensors ＆Bioelectronics，2005，20(7):1327-1332.

［12］Sung JH，Ko HJ，Park TH.Piezoelectric biosensor using olfactory receptor protein expressed in Escherichia coli［J］.Biosensors＆ Bioelectronics，2006，21(10):1981-1986.

［13］Wu Chunsheng，Tan Haimin，Yu Hui，et al.Piezoelectric biosensor based on olfactory receptor expressed in a heterologous cell system for drug discovery［A］.In:Peng Yi，Weng Xiaohong，eds.7th Asian-Pacific Conference on Medical and Biological Engineering［C］.Beijing:Springer，2008.313-316.

［14］Kaiser L，Graveland-Bikker J，Steuerwald D，et al.Efficient cell-free production of olfactory receptors: detergent optimization，structure，and ligand Binding analyses［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105(41):15726-15731.

The Study of Bionic Olfactory Receptor Sensor Based on Surface Acoustic Wave Device

DU Li-Ping1WU Chun-Sheng1WANG Di1WANG Le1LIU Qing-Jun1ZHAO Lu-Hang2WANG Ping1*
1)(Biosensor National Special Laboratory，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)2)(Department of Biochemistry and Genetics，School of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

R318

A

0258-8021(2010)04-0601-06

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.04.020

2010-03-06，

2010-04-27

國(guó)家杰出青年科學(xué)基金(60725102);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30700167)

*通訊作者。 E-mail:cnpwang@zju.edu.cn