冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)中高分辨率病毒的三維顯示

李 晶 李鯤鵬 柳 正 趙海燕

1(昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，昆明 650032)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

3(云南省第一人民醫(yī)院眼科，昆明 650032)

冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)中高分辨率病毒的三維顯示

李 晶1*李鯤鵬2柳 正2趙海燕3

1(昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，昆明 650032)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

3(云南省第一人民醫(yī)院眼科，昆明 650032)

利用冷凍電鏡顯微技術(shù)和單顆粒三維重建方法獲得分辨率為1.3 nm的BmCPV(家蠶質(zhì)多角體)，1.3 nm的BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物)，2.5 nm的CSBV中蜂囊裝幼蟲(chóng)病病毒，1.4 nm的 C6/36濃核病毒(C6/36DNV)組成的三維結(jié)構(gòu)體數(shù)據(jù)。對(duì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)歸并，并找到對(duì)顯示細(xì)節(jié)較為敏感的向量維度，用三維可視化技術(shù)對(duì)病毒做出快速高效顯示。與原有顯示方法相比，時(shí)間和信噪比有了顯著提高，病毒表面細(xì)節(jié)和軸上突起更加清晰可見(jiàn)。為高分辨病毒三維重構(gòu)開(kāi)辟了新的可視方法。

冷凍電子顯微技術(shù);三維重構(gòu);三維顯示;病毒

引言

病毒給予人類(lèi)極大的危害，防治病毒是人類(lèi)的重要任務(wù)。根據(jù)病毒結(jié)構(gòu)上20面體對(duì)稱(chēng)的特性，計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)與冷凍電鏡技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生冷凍電鏡單顆粒技術(shù)(CryoEM)，成為研究病毒結(jié)構(gòu)功能的主要手段［1］。應(yīng)用此技術(shù)對(duì)病毒研究，最早是Crowther提出的［2］。該技術(shù)利用20面體的對(duì)稱(chēng)性和中央截面定理，確定電子顯微圖像中病毒顆粒的空間取向和中心位置，然后把大量的、確定了取向和中心位置的病毒顆粒空間疊加，重構(gòu)出病毒的三維結(jié)構(gòu)。至今，已經(jīng)用此技術(shù)得到了大量病毒的三維結(jié)構(gòu)［3］。用 Fourier-Bessel 合成法［4］進(jìn)行三維重構(gòu)，所得到的體數(shù)據(jù)中包含了噪聲、空間疊加的位置誤差，以及傅里葉變換等重構(gòu)過(guò)程中的不良影響，導(dǎo)致在病毒的三維顯示中出現(xiàn)偽結(jié)構(gòu)［5］。為了消除這些影響，近年來(lái)出現(xiàn)了大量的病毒三維顯示的研究［6］。比較成熟已經(jīng)開(kāi)始在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室中大量使用的軟件有IRIS explorer，但它存在顯示速度慢、顯示參數(shù)較多、參數(shù)設(shè)定復(fù)雜、域值對(duì)噪聲的敏感度較低等缺陷。為此，本研究應(yīng)用可視化技術(shù)，首先對(duì)體數(shù)據(jù)進(jìn)行歸并，繼而分析了顯示平滑度和顯示細(xì)節(jié)之間的關(guān)系，建立了新的顯示域值體系。對(duì)高分辨率的重建數(shù)據(jù) BmCPV(家蠶質(zhì)多角體)、BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物)、CSBV中蜂囊裝幼蟲(chóng)病病毒、C6/36DNV(C6/36濃核病毒)進(jìn)行了三維顯示，得到了滿(mǎn)意的結(jié)果，并驗(yàn)證了方法的快速高效。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)進(jìn)行冷凍電鏡病毒單顆粒技術(shù)的三維重構(gòu)研究，現(xiàn)已經(jīng)得到多種較高分辨率的病毒三維重構(gòu)體數(shù)據(jù)。其中，包括有分辨率為1.3 nm的 BmCPV(家蠶質(zhì)多角體病毒)與1.3 nm的BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物［7］;2.5 nm的CSBV中蜂囊裝幼蟲(chóng)病病毒［8］;1.4 nm的C6/36濃核病毒(C6/36DNV)的三維結(jié)構(gòu)體數(shù)據(jù)［9］。以上述4種病毒高分辨三維重構(gòu)的體數(shù)據(jù)作為依據(jù)進(jìn)行三維顯示研究。

1.2 方法

體數(shù)據(jù)的三維顯示是將三維數(shù)據(jù)投影到二維圖像顯示器平面上，并利用計(jì)算機(jī)圖形學(xué)的原理和技術(shù)，通過(guò)使用光照、透視及旋轉(zhuǎn)等方法，獲得三維視覺(jué)效果。目前的三維顯示技術(shù)基本上可以分為面繪制和體繪制兩大類(lèi)。表面繪制的一般步驟是:首先在二維序列圖像上提取對(duì)象的輪廓線(xiàn)，然后利用三角形面片來(lái)近似相鄰的輪廓線(xiàn)之間的等值面，從而得到要顯示對(duì)象的完整表面，最后采用傳統(tǒng)的圖形學(xué)方法加以顯示。當(dāng)體數(shù)據(jù)的采樣密度足夠大時(shí)，可以采用MC(marching cube)方法在表面體素內(nèi)部提取等值面，得到高質(zhì)量的表面顯示結(jié)果。表面繪制的優(yōu)點(diǎn)是可以清晰顯示對(duì)象的表面情況，配合通用的顯卡加速，具有較好的實(shí)時(shí)交互性。體繪制技術(shù)出現(xiàn)的時(shí)間較晚，是近幾年三維顯示技術(shù)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。它可以完整地反映數(shù)據(jù)域中所包含的整體信息，不需要構(gòu)造中間幾何圖形元素，直接使三維空間數(shù)據(jù)場(chǎng)的采樣可視化，單獨(dú)或同時(shí)顯示濃淡變化的表面和灰度實(shí)體。

體數(shù)據(jù)的空間位置由體數(shù)據(jù)的空間坐標(biāo)決定，明暗屬性由每個(gè)像素點(diǎn)的方向矢量決定。方向矢量的計(jì)算是:給出了x方向上的分量，y、z方向的分量有同樣的形式，即

其中，N的大小決定了顯示表面的平滑度。隨著N增大，平滑程度逐漸提高，而細(xì)節(jié)卻逐漸消失。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)N=3時(shí)，兼顧了平滑效果和顯示細(xì)節(jié)，使顯示達(dá)到最佳效果。設(shè)體數(shù)據(jù)空間像素為M(x，y，z)，其均值 avg，則方差為

做如下數(shù)據(jù)歸并:當(dāng) M(x，y，z)≥avg+4msq時(shí)，取 M(x，y，z)=255;當(dāng) M(x，y，z)≤avg+4msq時(shí)，取 M(x，y，z)=0，其他為 M(x，y，z) ∈ (0，255)。

2 結(jié)果

基于以上方法研制開(kāi)發(fā)了針對(duì)單顆粒技術(shù)病毒重構(gòu)體數(shù)據(jù)的三維顯示方法，并在 PC機(jī)上的Visual C++8.0開(kāi)發(fā)環(huán)境下，附帶有 OPGL接口，自主開(kāi)發(fā)了應(yīng)用軟件Cryo-Electron Microscopy 3-Dimension Display System (CEM3DDS)。將CEM3DDS與IRIS explorer在顯示速度和信噪比方面進(jìn)行了比較得出以下結(jié)果。圖1為IRIS和CEM3DDS兩種軟件對(duì)相同體數(shù)據(jù)bmCPV在不同閾值下顯示耗時(shí)的比較。兩個(gè)軟件有在相同硬件條件的PC機(jī)上(CPU為AMD 3000，F(xiàn)ireGL T2-128)運(yùn)行，由圖1可見(jiàn)，相同的體數(shù)據(jù)在各個(gè)閾值下，對(duì)較小的閾值，顯示速度接近，在 A點(diǎn)(閾值100)以后，CEM3DDS的顯示速度明顯快于 IRIS。圖2為IRIS和CEM3DDS在不同閾值下信號(hào)與噪聲的幅度比較。實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了兩個(gè)軟件在不同閾值下所顯示圖像的信號(hào)以及噪聲的幅度。由圖2可見(jiàn):在閾值的整個(gè)取值范圍內(nèi)，CEM3DDS的信噪比大于IRIS的信噪比;說(shuō)明閾值在 CEM3DDS對(duì)噪聲更加敏感，有利于顯示質(zhì)量的提高。圖3是CEM3DDS對(duì)BmCPV與C6/36DNV的三維顯示;(a)和(b)為不同方位的BmCPV三維顯示圖像，病毒的細(xì)節(jié)清晰可見(jiàn);(c)和 (d)為 C6/36DNV的三維顯示，是從5次軸兩個(gè)不同方向觀察的結(jié)果。5次軸的定點(diǎn)突出，清晰可見(jiàn)。圖4為半個(gè) BmCPV+mab矢狀面、冠狀面和橫斷面3個(gè)中垂直面的顯示，CEM3DDS不但能夠?qū)Σ《具M(jìn)行三維外部結(jié)構(gòu)的顯示，還能對(duì)病毒內(nèi)部的任意剖面進(jìn)行顯示，可見(jiàn)BmCPV+mab病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰完整。圖 5是半個(gè) CSBV、BmCPV+mab的三維顯示，從不同方位的CSBV三維顯示圖像可見(jiàn)，外部細(xì)節(jié)分明，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰。同樣，BmCPV+mab的三維顯示可見(jiàn)，BmCPV與 mab結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)清晰。由圖3與圖5的比較，可見(jiàn)BmCPV與 BmCPV+mab在結(jié)構(gòu)上的不同，在BmCPV+mab突起的頂點(diǎn)多出了一個(gè)結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為ASpike，這個(gè)部分的結(jié)構(gòu)與病毒功能有著密切的關(guān)系［10］。

圖1 IRIS和CEM3DDS在不同閾值下顯示速度的比較Fig.1 Comparison of display speed between IRIS and CEM3DDS under different threshold

圖2 IRIS和CEM3DDS在不同閾值下信號(hào)與噪聲的幅度比較Fig.2 Amplitudes of signal and noise of IRIS and CEM3DDS under different threshold

圖3 BmCPV與C6/36DNV的三維顯示。(a)BmCPV 30°方位角;(b)BmCPV 60°方位角;(c)C6/36DNV 30°方位角;(d)C6/36DNV 60°方位角Fig.3 3D display results of BmCPV and C6/36DNV.(a)BmCPV azimuthalangle30°;(b)BmCPV azimuthal angle 60°;(c)C6/36DNV，azimuthal angle 30°;(d)C6/36DNV，azimuthal angle 60°

圖4 BmCPV+mab一半體數(shù)據(jù)中垂直面的顯示。(a)矢狀面;(b)冠狀面;(c)橫斷面Fig.4 3D display of a hemispherical volume data.(a)vertical section;(b)coronal;(c)transect

圖5 CSBV，BmCPV+mab的三維顯示，(a)CSBV，90°方位角;(b)CSBV，－90°方位角;(c)CSBV，0°方位角;(d)CSBV，30°方位角;(e)BmCPV+mab，90°方位角;(f)BmCPV+mab，－90°方位角;(g)BmCPV+mab，0°方位角;(h)BmCPV+mab，30°方位角Fig.5 3D display results of CSBV and BmCPV+mab.(a)CSBV，azimuthal angle 90°;(b)CSBV，azimuthal angle －90°;(c)CSBV，azimuthal angle 0°;(d)CSBV，azimuthal angle 30°;(e)BmCPV+mab，azimuthal angle 90°;(f)BmCPV+mab，azimuthal angle － 90°;(g)BmCPV+mab，azimuthal angle 0°;(h)BmCPV+mab，azimuthal angle 30°

3 討論

冷凍電鏡計(jì)算機(jī)的三維重構(gòu)技術(shù)包括:樣品制備、冷凍電鏡成像和數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、三維結(jié)構(gòu)顯示和解釋。重構(gòu)過(guò)程非常復(fù)雜，往往同樣的樣品、同樣的重構(gòu)條件，得出不同的重建顯示結(jié)果。導(dǎo)致重構(gòu)結(jié)果誤差的主要因素包括:樣品的電子輻射損傷、電子源的空間相干性、病毒圖像的低襯度導(dǎo)致確定病毒顆粒的取向和中心的誤差，其結(jié)果均是在所重構(gòu)的體數(shù)據(jù)中包含了病毒的偽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。筆者通過(guò)體數(shù)據(jù)場(chǎng)的數(shù)據(jù)歸并，控制方向矢量求解中的矢量維度，獲得了新的病毒顯示方法。新方法用于可用單顆粒技術(shù)重構(gòu)的病毒，這種技術(shù)要求病毒樣品是全同性的。

就顯示方法而言，CEM3DDS是由灰度體數(shù)據(jù)直接顯示的，避免了面顯示等值面提取帶來(lái)的誤差。同時(shí)，通過(guò)不同透明度和顏色的設(shè)定，可以顯示對(duì)象內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和特征，其缺點(diǎn)是較表面顯示要計(jì)算量大。但是，對(duì)于生物樣品，直接顯示技術(shù)能提供更重要的結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)對(duì)體數(shù)據(jù)進(jìn)行的數(shù)據(jù)歸并，首先對(duì)體數(shù)據(jù)的范圍進(jìn)行了壓縮，有利于顯示速度的提高;其次使每個(gè)圖像數(shù)據(jù)均具有三維體數(shù)據(jù)的整體信息，使得閾值對(duì)噪聲的敏感性增強(qiáng)，有利于高效地顯示圖像信息。與 IRIS explorer方法進(jìn)行了比較，CEM3DDS在顯示速度、閾值噪聲響應(yīng)等方面，均有較大提高。在使用時(shí)，IRIS explorer需要設(shè)置多個(gè)顯示參數(shù)，一旦參數(shù)選擇不符合要求，病毒的重要結(jié)構(gòu)將不能顯示，尤其對(duì)初學(xué)者。而在CEM3DDS設(shè)計(jì)時(shí)，已將部分參數(shù)設(shè)置于程序之中，不需要使用軟件在界面上設(shè)置。例如，IRIS explorer將三維光照效果的參數(shù)均放于用戶(hù)界面上，供使用者調(diào)整，但軟件的初學(xué)者很難進(jìn)行正確的選擇。而CEM3DDS已經(jīng)在程序中將光照效果設(shè)置好，無(wú)需在程序界面中調(diào)整光照。另外，新方法CEM3DDS將閾值壓縮在0～255之間，而 IRIS explorer的閾值無(wú)限定。這說(shuō)明，在閾值的選擇和設(shè)置時(shí)，CEM3DDS的操作比IRIS explorer要簡(jiǎn)潔。

［1］ DeRosier DJ.Who needs crystals anyway?［J］.Nature，1997，386:26－27.

［2］ Crowther RA，Amos LA，F(xiàn)inch JT，et al.Three dimensional reconstructions of spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs［J］.Nature，1970，226(244):421 －425.

［3］ Chiu W，Burnett RM，Garcea R.Structural biology of viruses［D］.New York:Oxford University Press，1996.

［4］ Crowther RA，Procedures for three-dimensional reconstruction of spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs［J］.Phil.Trans，1971，261:221 －230.

［5］ Liu H，Qu C，Johnson JE，et al.Pseudo-atomic models of swollen CCMV from cryo-electron microscopy data［J］.J Struct Biol，2003，142(3):356 －363.

［6］ Halperin I，Wolfson H，Nussinov R.SiteLight:binding-site prediction using phage display libraries［J］.Protein Sci，2003，12(7):1344－1359.

［7］ Xia Q，Joanita J，Zhang JQ，et al.Structural Comparisons of Empty and Full Cytoplasmic Polyhedrosis Virus［J］.J Struct Biol Vol.2003，278(2):1094－1100，

［8］ 張景強(qiáng)，馮建勛，梁玉堯，等.中蜂囊狀幼蟲(chóng)病病毒的三維結(jié)構(gòu)研究 ［J］.中國(guó)科學(xué) C 輯，2001，31(3):1－5.

［9］ 陳凌鵬，陳森雄，Jenifer BJ，等.伊蚊C6/36細(xì)胞濃核病毒蛋白衣殼三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定 ［J］.中國(guó)科學(xué) C輯，2004，34(1):75－79.

［10］ Zhang HJ，Zhang X，Yu X，et al.Visualization of Protein-RNA Interactions in Cytoplasmic Polyhedrosis Virus［J］.Journal of Virology，1999，73(2):1624 － 1629.

3D Display of High-resolution Virus in Electron Cryomicroscopy Single Particle Reconstruction

LI Jing1*LI Kun-Peng2LIU Zheng2ZHAO Hai-Yan3
1(Department of Medical Engineering of Kunming General Hospital，Kunming 650032，China)
2(State Key Laboratory for Biocontrol，School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China)
3(Department of Ophthalmology，The First People Hospital of Yunnan Provin，Kunming 650032，China)

electron eryo-microscopy;3D display;virus

R318.07

D

0258-8021(2010)04-0632-04

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.04.025

2009-09-23，

2010-05-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770540);成都軍區(qū)醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃課題(MB07026)

*通訊作者。E-mail:li_jingkm@126.com