從脫脂米糠中提取蛋白質(zhì)和植酸的研究

朱春鳳 湯冬梅 周明達(dá)

米糠具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，且來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，因此開發(fā)米糠的營(yíng)養(yǎng)成分具有很好的實(shí)用價(jià)值[1-2]。目前米糠蛋白的提取方法主要有堿法和酶法，傳統(tǒng)堿法在高pH值下得到米糠蛋白容易變性[3]；采用酶法[4-5]避免了這一缺點(diǎn)，酶法具有反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短、消耗量少等優(yōu)點(diǎn)。植酸的提取方式主要是酸浸取法[6-7]，但該方法浸提時(shí)間長(zhǎng)，工藝路線長(zhǎng)，且生產(chǎn)費(fèi)用高。目前，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道從米糠中同時(shí)提取蛋白和植酸，因此本文采用超聲結(jié)合酶法，利用超聲的空化效應(yīng)促進(jìn)米糠中有效成分的溶出，以克服傳統(tǒng)酶法蛋白提取率低、植酸浸提時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，結(jié)合酶法提高植酸和蛋白質(zhì)的提取量，能更多地保留蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降低生產(chǎn)成本，為米糠中營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)開發(fā)開辟了新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 原料與試劑

脫脂米糠（市售）；纖維素酶（cellulase）：杰輝生物科技有限公司，活力單位≥400 μ/mg；木瓜蛋白酶（papain）：杰輝生物科技有限公司，活力單位≥800 μ/mg；果膠酶（pectinase）：杰輝生物科技有限公司，活力單位≥500 μ/mg；其它試劑：均為分析純。

1.2 儀器

高速組織搗碎機(jī)，攪拌器，恒溫水浴鍋，離心機(jī)，pH計(jì)，離子交換柱，超聲波發(fā)生器，抽濾裝置，濃縮儀，紫外-可見分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取脫脂米糠20 g于燒杯中，根據(jù)料液比1：10（W：V）加自來(lái)水，攪拌均勻，放入超聲器中超聲30 min，然后依據(jù)三種酶調(diào)適當(dāng)?shù)膒H值和溫度（T），加入一定量的酶，恒溫2 h后，過(guò)濾，收集濾液定容至250 ml，測(cè)定蛋白質(zhì)[9]，在100℃下加熱30 min使蛋白質(zhì)變性[10]后，測(cè)定植酸[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)提取的影響

2.1.1 超聲波處理的影響

實(shí)驗(yàn)條件：米糠20g，料液比1：10，超聲時(shí)間30min，果膠酶量[E]/[S]=2%(pH=3.5,T=50℃)，恒溫2 h。由表1可看出，超聲預(yù)處理后米糠蛋白和植酸的提取量較不用超聲處理的高，先加酶后超聲不利蛋白和植酸的提取。超聲波的振動(dòng)破壞細(xì)胞壁，可以促進(jìn)蛋白和植酸的同時(shí)溶出，但超聲技術(shù)對(duì)酶的活性起到一定的破壞作用，因此先超聲后加酶法更有利于脫脂米糠蛋白和植酸的提取。

表1 超聲波處理對(duì)米糠蛋白質(zhì)和植酸提取的影響

2.1.2 超聲時(shí)間的影響

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)提取的影響，結(jié)果如圖1。由圖1可知，在30 min以前米糠蛋白和植酸的提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，30 min以后提取量基本保持不變。這是由于在30 min后，絕大多數(shù)的水溶性蛋白和植酸已經(jīng)從細(xì)胞壁中溶出，剩下的蛋白和植酸與細(xì)胞中的纖維素結(jié)合在一起。因此，最佳超聲處理時(shí)間為30 min。

圖1 超聲波處理時(shí)間對(duì)米糠蛋白和植酸的提取的影響

2.2 料液比的影響

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了料液比（W：V）分別為1：5、1：10、1：15時(shí)，同時(shí)提取米糠蛋白和植酸的影響，結(jié)果見表2。

表2 料液比對(duì)脫脂米糠蛋白質(zhì)和植酸提取的影響

由表2可知，在料液比為1：10時(shí)，其蛋白提取量稍低于料液比1：15，但從水的去除成本考慮，料液比以1：10為佳。

2.3 三種酶對(duì)脫脂米糠蛋白和植酸提取的影響

2.3.1 酶用量對(duì)提取的影響

在三種酶最適pH值和溫度（T）條件下，考察了酶的用量對(duì)米糠蛋白和植酸的提取影響，結(jié)果如圖2和圖3。從結(jié)果可知，隨著酶添加量的增加，脫脂米糠中蛋白質(zhì)和植酸的提取量先增加后基本保持不變。由圖2可知，酶添加量從0.5%～2.5%，蛋白提取量提高的幅度不大，因?yàn)榻^大多數(shù)的水溶性蛋白已經(jīng)從細(xì)胞壁中溶出來(lái)了；木瓜蛋白酶提取的蛋白質(zhì)，其提取量較果膠酶、纖維素酶的高。由圖3可知，果膠酶提取的植酸，其提取量較纖維素酶和木瓜蛋白酶的高。從結(jié)果得知，纖維素酶和果膠酶最佳用量為2%，木瓜蛋白酶最佳用量為1.5%。

圖2 不同量的酶對(duì)脫脂米糠蛋白質(zhì)提取的影響

圖3 不同量的酶對(duì)脫脂米糠植酸提取的影響

2.3.2 溫度的影響

在纖維素酶和果膠酶用量為2%，木瓜蛋白酶用量為 1.5%情況下，溫度分別設(shè)為 14、20、30、40、50、60℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4和圖5。從圖4、圖5可以看出，脫脂米糠中蛋白質(zhì)和植酸的提取量隨著溫度的升高而增加，因?yàn)闇囟鹊纳呖梢越档图?xì)胞壁對(duì)蛋白質(zhì)和植酸的作用力，有利于它們的溶出。從圖4總體曲線來(lái)看，果膠酶對(duì)蛋白質(zhì)量的提取低于纖維素酶和木瓜蛋白酶的提取量；當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，纖維素酶和木瓜蛋白酶提取的蛋白質(zhì)曲線相似，這兩種酶的活性基本達(dá)到一致。從圖5可以得知，果膠酶對(duì)植酸的提取量明顯高于纖維素酶和木瓜蛋白酶。總體考慮，纖維素酶和木瓜蛋白酶的最高活性的溫度為40℃，果膠酶的最高活性的溫度為50℃。

圖4 溫度對(duì)不同酶從脫脂米糠中提取蛋白質(zhì)的影響

圖5 溫度對(duì)不同酶從脫脂米糠中提取植酸的影響

2.3.3 pH值對(duì)提取的影響

在纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶最高活性的溫度下，考察pH值對(duì)米糠蛋白和植酸提取的影響。從圖6和圖7可知，隨著pH值的增大，脫脂米糠中蛋白質(zhì)的提取量逐漸增加，而植酸的提取量則逐漸降低。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在堿性條件下的提取量高，而植酸在pH值約為1.5～3.0的酸性溶液中更易溶出。從蛋白和植酸同時(shí)提取的量考慮，纖維素酶和木瓜蛋白酶以pH=4.5為佳，果膠酶以pH=3.5為佳。

圖6 pH值對(duì)不同酶從脫脂米糠中提取蛋白質(zhì)的影響

圖7 pH值對(duì)不同酶從脫脂米糠中提取植酸的影響

2.4 兩種酶復(fù)合作用對(duì)脫脂米糠蛋白和植酸提取的影響

在單一酶的基礎(chǔ)上，只采用纖維素酶或木瓜蛋白酶對(duì)蛋白的提取效果更好，但不利于植酸的提??；只采用果膠酶對(duì)蛋白和植酸的提取結(jié)果則相反。因此考慮兩種酶復(fù)合作用對(duì)脫脂米糠蛋白和植酸提取的影響。

2.4.1 木瓜蛋白酶和纖維素酶復(fù)合作用

由于木瓜蛋白酶和纖維素酶作用底物不同，所以用這兩種酶分別作用。先用纖維素（[E]/[S]=2%，T=40℃，pH=4.5）破壞細(xì)胞壁，使植酸和蛋白質(zhì)同時(shí)溶出，加入木瓜蛋白酶（[E]/[S]=1.5%，T=40 ℃，pH=4.5）進(jìn)一步提高植酸和蛋白質(zhì)的提取量，結(jié)果米糠蛋白量為1.537 3 g，植酸量為1.280 8 g。由此可以得知，同時(shí)使用這兩種酶可以略微提高蛋白質(zhì)的量，對(duì)植酸的提取影響不大。

2.4.2 木瓜蛋白酶和果膠酶復(fù)合作用

由于植物細(xì)胞壁含有部分果膠和半纖維素，先用果膠酶（[E]/[S]=2%，T=50℃，pH=3.5）破壞細(xì)胞壁，使植酸和蛋白質(zhì)同時(shí)溶出，加入木瓜蛋白酶（[E]/[S]=1.5%，T=40℃，pH=4.5）是否可以進(jìn)一步提高植酸和蛋白質(zhì)的提取，結(jié)果米糠蛋白量為1.256 4 g，植酸量為1.238 6 g。這說(shuō)明木瓜蛋白酶和果膠酶不適合共同使用，會(huì)降低米糠蛋白和植酸量的提取。

2.4.3 果膠酶和纖維素酶的復(fù)合作用

由于果膠是細(xì)胞壁組成部分，在有纖維素酶存在的情況下同時(shí)加入果膠酶。具體操作先加纖維素酶（[E]/[S]=2%，T=40℃，pH=4.5）后加果膠酶（[E]/[S]=2%，T=50 ℃，pH=3.5），結(jié)果米糠蛋白量為 1.810 6 g，植酸量為1.431 4 g。由此得知，纖維素酶和果膠酶的復(fù)合作用優(yōu)于單一酶法，在相應(yīng)的基礎(chǔ)上，比單一使用纖維素酶蛋白質(zhì)提取量提高了0.4 g左右，比單一使用果膠酶植酸提取量提高了0.2 g左右。

表3 重現(xiàn)性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

本文使用了超聲結(jié)合酶的方法，對(duì)從脫脂米糠中同時(shí)提取蛋白質(zhì)和植酸進(jìn)行了探討，優(yōu)化得到了提取的最佳條件：在料液比1：10的情況下超聲30 min后，使用果膠酶提取的植酸高于纖維素酶和木瓜蛋白酶，纖維素酶和木瓜蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的提取效果基本一致，纖維素酶和果膠酶的復(fù)合法優(yōu)于單一酶法，得到米糠蛋白量1.804 3 g，植酸量1.430 5 g，在原有的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)提取量提高了0.4 g左右，植酸提取量提高了0.2 g左右。此法可以保持米糠蛋白的較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和有較高的提取量，避免傳統(tǒng)堿法提取蛋白所帶來(lái)的負(fù)面影響，同時(shí)可以縮短植酸的浸提時(shí)間，提高植酸的提取量，降低生產(chǎn)成本，為充分利用我國(guó)米糠資源提供了廣闊的空間。

[1]曹國(guó)鋒，龔任，王舒平，等.米糠資源開發(fā)利用的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2000(07):42-44.

[2]梁少華，趙西周，胡前.米糠深加工技術(shù)的分析與評(píng)價(jià)(Ⅰ)——米糠制油及脫脂米糠的利用[J].中國(guó)油脂,2005,30(10):41-44.

[3]陳正行，姚惠源，周素梅.米蛋白和米糠蛋白開發(fā)利用[J].糧食和油脂，2002(4):6-10.

[4]王雪飛，于國(guó)萍，徐紅華.不同酶法提取米糠蛋白的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004,19(1):8-11.

[5]WangM,HettiarachchyN S,QiM.Preparation and functional properties of rice bran protein isolate[J].J Agric Food Chem,1999,47:411-416.

[6]陳大淦，曹棟，裘愛泳.提高植酸得率的研究[J].中國(guó)油脂，1992(03):16-19.

[7]天玉珍，趙有貴.用麥麩制取植酸鈣的研究[J].河北化工，1996(1):34-35.

[8]曹紅翠.紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[J].廣東化工，2007,34(8):93-94.

[9]王雪飛.酶法制備米糠分離蛋白的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[10]許金林，汪遠(yuǎn)金，傅惠英.三氯化鐵法測(cè)定植酸[J].化學(xué)世界，1993(10):494-497