鉛抗性細(xì)菌的篩選及其對(duì)鉛活化的研究

王旭梅，盛 楠，王紅旗

（1.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京 100875；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

鉛在土壤中遷移轉(zhuǎn)化能力弱、溶解度低，由于人類(lèi)對(duì)鉛的過(guò)度開(kāi)采和使用，打破了鉛在生態(tài)循環(huán)中的平衡，導(dǎo)致嚴(yán)重的全球性鉛污染。因此，鉛污染土壤的修復(fù)成為目前各國(guó)普遍關(guān)注的研究?jī)?nèi)容之一。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)超積累植物對(duì)沉淀態(tài)的鉛無(wú)法吸收等缺點(diǎn)，限制了在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[1-3]。而微生物對(duì)重金屬的溶解作用在土壤污染修復(fù)中有很多用途，尤其是微生物繁殖迅速，不影響土壤的利用，可以方便地用遺傳手段改造以增強(qiáng)其活力，應(yīng)用前景廣闊[4-5]。因此，可以提高植物富集土壤中重金屬效能并環(huán)境友好的微生物強(qiáng)化措施得以提出。微生物通過(guò)自身代謝活動(dòng)及產(chǎn)物促進(jìn)重金屬的溶解，提高重金屬在土壤中的生物有效性，促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收，此外微生物還能分泌植物激素促進(jìn)植物旺盛生長(zhǎng)、增大生物量、提高植物修復(fù)土壤重金屬污染的效率[6-7]。

本研究從受重金屬鉛污染的土壤中篩選到2株產(chǎn)酸能力強(qiáng)、對(duì)鉛有較強(qiáng)抗性的細(xì)菌，并對(duì)細(xì)菌活化沉淀態(tài)鉛的環(huán)境影響因子進(jìn)行分析研究，為供試菌株的實(shí)際應(yīng)用及強(qiáng)化植物富集重金屬鉛等提供理論依據(jù)和試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤

土樣1（篩選菌種）：以五點(diǎn)法采集5～10 cm土層樣品，分別取自北京焦化廠和首鋼段永定河岸邊，含 Pb 量在 48～85 mg·kg-1之間。

土樣2：供試土樣采自北京沙河區(qū)菜園，土壤主要理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)含量1.09%，速效氮含量37.25 mg·kg-1，速效磷 8.56 mg·kg-1，速效鉀 80.21 mg·kg-1，pH 6.8。將供試土樣風(fēng)干、磨細(xì)過(guò)100目篩，在32只鋁盒中均等地放入土樣，每盒土樣均為6.00 g，然后于130℃烘箱，干熱滅菌3 h。

1.1.2 試驗(yàn)藥品

硝酸鉛分析純、碳酸鉛分析純均購(gòu)自北京市化工技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

有氮培養(yǎng)基：蔗糖 10 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，CaCO30.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，瓊脂20 g。Pb（NO3）2配成 104mg·L-1的溶液?jiǎn)为?dú)滅菌，然后與培養(yǎng)基混合倒平板，Pb2+的濃度分別為100、200、400、800 mg·L-1。液體培養(yǎng)時(shí)不加CaCO3和瓊脂[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鉛抗性菌株分離篩選及初步鑒定

經(jīng)10倍稀釋法，將10-4、10-5、10-6的土壤稀釋液分別涂布于固體有氮培養(yǎng)基上[9]，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，逐步提高培養(yǎng)基中的鉛離子濃度，挑取含鉛量為800 mg·L-1的有氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)豐滿的單菌落，隨著不斷移植，雜菌被慢慢淘汰，而得到比較純的菌種[10]，于4℃下保存。將分離所得的菌株活化18 h，接入2%重金屬鉛抗性篩選液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48 h后用pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定pH，觀察試管底部沉淀態(tài)鉛的變化，同時(shí)鏡檢。選出兩株pH變化明顯、鉛沉淀物減少、生物量高的菌株（JH13和Y7）作為以下試驗(yàn)的材料。

1.2.2 菌株JH13和Y7對(duì)培養(yǎng)液中沉淀態(tài)鉛的活化試驗(yàn)

在250 mL三角瓶中裝入100 mL有氮液體培養(yǎng)基，加入PbCO30.02 g，使其濃度在鉛全部溶解的條件下：Pb2+為400 mg·L-1，115℃高溫濕熱滅菌20 min。供試菌株接種于以上培養(yǎng)基，在30℃、120 r·min-1搖床預(yù)培養(yǎng)2 d，以未接種的重金屬培養(yǎng)液為對(duì)照，分別在12、24、48、72 h取樣，用pH計(jì)測(cè)定接菌培養(yǎng)液中pH，以確定其代謝產(chǎn)酸能力；培養(yǎng)液離心（10 000 r·min-1，3 min）使菌體和未活化的重金屬沉淀，取上清液，原子吸收法測(cè)上清液中Pb2+濃度；同時(shí)測(cè)定對(duì)照的pH、Pb2+濃度。

1.2.3 菌株JH13和Y7對(duì)土壤中沉淀態(tài)鉛的活化試驗(yàn)

在無(wú)菌工作臺(tái)上，將稱(chēng)取的PbCO30.02 g與經(jīng)過(guò)干熱滅菌的土樣2混勻倒入50 mL三角瓶?jī)?nèi)，共準(zhǔn)備32瓶（每個(gè)菌種16瓶），每株菌隨機(jī)分成4組，每組4瓶。先將以純化的菌株活化18 h，然后接種于50 mL三角瓶中，每瓶接菌6 mL，每組只接種3瓶，另1瓶不接菌，用作對(duì)照。培養(yǎng)及測(cè)定方法同培養(yǎng)液中鉛的活化試驗(yàn)，只有培養(yǎng)液離心時(shí)間不同（10 000 r·min-1，5 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛抗性菌株分離篩選及初步鑒定

從含Pb2+100 mg·L-1的培養(yǎng)基中分離得到19株抗性菌株。逐步提高Pb2+濃度，在含Pb2+800 mg·L-1的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的細(xì)菌共4株。以代謝產(chǎn)酸及活化鉛沉淀物能力強(qiáng)、生長(zhǎng)勢(shì)及抗逆性強(qiáng)為復(fù)篩條件，篩選出2株高效鉛抗性菌株（菌株JH13和Y7），通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征等分析[11]，初步鑒定菌株JH13屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）、Y7屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。

2.2 抗性細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)液中沉淀態(tài)鉛的活化試驗(yàn)

由圖1、2可以看出，經(jīng)過(guò)搖床培養(yǎng)后兩株菌分別使含PbCO3培養(yǎng)液中的沉淀態(tài)鉛發(fā)生變化，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH逐漸降低，活化鉛含量逐漸升高，而未經(jīng)菌液處理的對(duì)照培養(yǎng)液中沉淀態(tài)鉛含量和pH，基本保持不變。24 h之間，與對(duì)照相比，兩株菌對(duì)鉛的活化量，都成正比例升高，但24～48 h之間，活化量急劇增加，為前24 h活化總量的2倍之多，此時(shí)，培養(yǎng)液的pH急劇降低與活化態(tài)鉛的變化成負(fù)相關(guān)，JH13的pH由6.1降至4.2，Y7的pH由5.9降至4.0。由此可知，供試菌株JH13和Y7對(duì)沉淀態(tài)鉛有很強(qiáng)的活化效能，其活化作用與供試菌株的代謝產(chǎn)酸能力相關(guān)。

圖1 抗鉛細(xì)菌JH13對(duì)培養(yǎng)液中PbCO3的活化Fig.1 Activation of PbCO3in liquid culture medium by lead-resistant JH13 strains

圖2 抗鉛細(xì)菌Y7對(duì)培養(yǎng)液中PbCO3的活化動(dòng)態(tài)Fig.2 Activationd developments of PbCO3in liquid culture medium to lead-resistant Y7 strains

由表1可看出，與對(duì)照相比， JH13活化鉛含量始終高于Y7，24 h至48 h之間，JH13的活化量大于Y7，但48 h之后，JH13的活化量有所降低，而Y7仍小幅上升。造成這種現(xiàn)象的原因，可能與菌株本身吸附一部分Pb2+或與代謝產(chǎn)物有關(guān)。

表1 經(jīng)抗性細(xì)菌處理后上清液中可溶性Pb2+含量Table 1 Concentration of soluble Pb2supernatants through resistant treatment （mg·L-1）

2.3 抗性菌株對(duì)土壤中沉淀態(tài)鉛的活化實(shí)驗(yàn)

將兩株菌接入含PbCO3的土樣2中，由表2可看出，JH13對(duì)沉淀態(tài)鉛的活化量高于Y7。由圖3可看出，pH變化曲線與對(duì)照相比有較大幅度的降低。由此發(fā)現(xiàn)，不論在培養(yǎng)液中還是在土壤中，皆是JH13對(duì)鉛的活化量高于Y7、皆是pH變化曲線趨勢(shì)逐漸降低，但菌株對(duì)沉淀態(tài)鉛的活化量始終低于培養(yǎng)液中的活化量。由此進(jìn)一步說(shuō)明，菌株對(duì)重金屬沉淀態(tài)鉛的活化，不僅與代謝產(chǎn)酸有關(guān)，還可能與菌體生活環(huán)境等有相關(guān)性。JH13、Y7對(duì)土壤pH的影響（菌體本身的pH基本是穩(wěn)定的，只能是其活動(dòng)改變外部環(huán)境的pH）。

表2 兩株供試菌株對(duì)土壤中沉淀態(tài)PbCO3的活化量Table 2 Activation of precipitation fraction PbCO3in soil by two strains tested （mg·L-1）

圖3 兩株供試菌株在土壤中的pH變化曲線Fig.3 Change curve of pH of two bacterial strains tested in soil

3 結(jié)論

a.從受重金屬污染場(chǎng)地的土壤中分離篩選出兩株高效活化沉淀態(tài)鉛的細(xì)菌（JH13和Y7），初步鑒定屬于芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬。

b.分別在培養(yǎng)液和土壤中，投入菌株的活化研究結(jié)果研究表明，兩株菌對(duì)沉淀態(tài)鉛都有很強(qiáng)的活化效能，且活化量高于對(duì)照達(dá)2倍之多。

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