咪唑乙煙酸降解菌Y發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

馬 超，李曉雨，劉亞光

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

咪唑乙煙酸（Imazethapyr），是美國(guó)氰胺公司80年代初開發(fā)研制的咪唑啉酮類性除草劑，主要用于大豆田苗前防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，具有殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、活性高等優(yōu)點(diǎn)[1]。目前中國(guó)主要在東北地區(qū)單季大豆田中使用，其中黑龍江省使用量最大，近幾年使用量在4 000 t左右[2-3]。咪唑乙煙酸的殘效期長(zhǎng)，在土壤中的殘留會(huì)對(duì)下茬敏感作物產(chǎn)生藥害，3年內(nèi)后茬禁種大豆、玉米、小麥以外的作物，尤其以甜菜、馬鈴薯、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物對(duì)其極為敏感[4]，更由于其連年使用，殘留藥害問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重影響了種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和換茬輪作，已成為亟待解決的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問(wèn)題。因此，如何解決咪唑乙煙酸的殘留藥害問(wèn)題一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，研究表明，在土壤表土層以下的咪唑乙煙酸不水解、不揮發(fā)，主要通過(guò)微生物降解而消失[5]。

目前采用富集分離的方法已經(jīng)在受咪唑乙煙酸污染的土壤中篩選出一株能夠高效降解咪唑乙煙酸的菌株Y，為海球菌屬（Marinococcus），并對(duì)其生長(zhǎng)特性、降解性能等方面進(jìn)行了研究[6-7]。由于原培養(yǎng)基的發(fā)酵效率較低，且對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)存在成本高的問(wèn)題，本文對(duì)已篩選出的咪唑乙煙酸的降解菌Y的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，以明確其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組合，充分發(fā)揮菌種的生長(zhǎng)潛力，提高降解菌產(chǎn)率，降低發(fā)酵成本，為降解菌劑的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，以期為生物修復(fù)該除草劑污染的耕地、解決換茬輪作調(diào)整提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

咪唑乙煙酸降解菌Y，為海球菌屬（Marinococcus），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥與雜草教研室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

在250 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%的接菌量接菌，接菌后于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)30 h。

1.4 降解菌Y生長(zhǎng)量的測(cè)定方法

發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)在650 nm下比色測(cè)定降解菌Y的數(shù)量。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 碳源篩選試驗(yàn)

選取葡萄糖、淀粉、玉米面、麥麩皮、米糠、玉米秸稈和大麥粉分別替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，添加濃度不變，培養(yǎng)基中其他組分不變，按上述搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)，測(cè)定降解菌Y的生長(zhǎng)量，比較各種碳源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響。

1.5.2 氮源篩選試驗(yàn)

選取黃豆粉、豆粕、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaNO3、NH4NO3和（NH4）2SO4，分別替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，添加濃度不變，培養(yǎng)基中其他組分不變，對(duì)降解菌Y進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定降解菌Y的生長(zhǎng)量，比較各種氮源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響。

1.5.3 無(wú)機(jī)鹽篩選試驗(yàn)

選取 ZnSO4，MgSO4，K2HPO4，F(xiàn)eSO4，MnCl2，CaCl2，CoCl2等作為唯一無(wú)機(jī)鹽，并設(shè)置不同的濃度，分別替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，對(duì)降解菌Y進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，比較不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)的影響。

1.5.4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各個(gè)因素對(duì)發(fā)酵的影響，選取麥麩皮、米糠、豆粕、酵母粉、NaCl、CaCl2和FeSO4作為組分因子，采用L18（37）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成，試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析，確定最佳培養(yǎng)基組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響

碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，其主要作用是供給菌種生命活動(dòng)所需要的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物中的碳素來(lái)源[8]。由圖1可知，麥麩皮和米糠作為碳源時(shí)降解菌Y生長(zhǎng)量最高，與其他5種碳源差異顯著，其次是大麥粉、玉米面、玉米秸稈和葡萄糖，并且菌株利用淀粉的能力不強(qiáng)，大量多糖無(wú)法被菌體利用從而影響菌體的生長(zhǎng)。麥麩和米糠的價(jià)格低廉，取材方便等特點(diǎn)作碳源適于大規(guī)模生產(chǎn)，因此選擇麥麩和米糠作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖1 不同碳源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響Fig.1 Influence of different carbon sources on the biomass of degrading bacteria Y

2.2 不同氮源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響

結(jié)果見圖2。

氮源微生物發(fā)酵中的主要原料之一，其主要功能是構(gòu)成微生物細(xì)胞和含氮的代謝產(chǎn)物，常用的氮源含有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩大類[9]。由圖2可以看出，選擇豆粕和酵母粉作為氮源時(shí)菌體生長(zhǎng)量較大，方差分析可知與其他氮源相比有顯著差異，其次為蛋白胨、硝酸銨、硝酸鈉和硫酸銨，降解菌Y對(duì)豆粉和尿素的利用能力很低。酵母浸粉是常用的速效氮源，豆粕是良好的持效氮源，為降解菌Y持續(xù)良好的生長(zhǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)的需要，選擇這兩種氮源配合作為發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖2 不同氮源對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響Fig.2 Influence of different nitrogen sources on the biomass of degrading bacteria Y

2.3 不同無(wú)機(jī)鹽及質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響

無(wú)機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)，其主要功能是構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成成分、調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓平衡等[10]。結(jié)果如表1所示，在所選的8種無(wú)機(jī)鹽中NaCl和CaCl2對(duì)降解菌Y的生長(zhǎng)均有較顯著的促進(jìn)作用，并且隨著其添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加降解菌Y生長(zhǎng)量也隨之增加，兩者都在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大；FeSO4在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)菌體生長(zhǎng)量最大，但隨添加的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.07%時(shí)菌體生長(zhǎng)量有所下降。而 KH2PO4，MgSO4，ZnSO4，MnCl2和 CoCl2對(duì)菌體生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用也增強(qiáng)。

表1 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)降解菌Y生長(zhǎng)量的影響Table 1 Influence of different inorganic salt on the biomass of degrading bacteria Y

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)的因素及水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。通過(guò)均值間比較可以看出發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為 A2B3C3D2E2F2G3，即麥麩皮 2%，米糠2.5%，豆粕2%，酵母粉1%，NaCl 0.8%，CaCl20.6%，F(xiàn)eSO40.015%。分析極差值的大小得出影響降解菌Y生長(zhǎng)的因素依次為：豆粕＞麥麩＞米糠＞酵母粉＞FeSO4＞CaCl2＞NaCl，經(jīng)方差分析各因素在0.05水平上均不存在顯著性差異，分析認(rèn)為單因素試驗(yàn)中確定了各個(gè)因素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動(dòng)較小，因此結(jié)果間差異不顯著。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for fermentation medium optimization （%）

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis the rsulsts of orthogonal design

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成應(yīng)做到適當(dāng)豐富和完備，滿足菌體迅速生長(zhǎng)需要，營(yíng)養(yǎng)過(guò)多或過(guò)少都不利于菌體的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足會(huì)導(dǎo)致菌體提前進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)量減少；營(yíng)養(yǎng)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致菌代謝途徑發(fā)生一定的改變，造成底物抑制，不僅生物量減少，同時(shí)造成產(chǎn)物量減少，對(duì)產(chǎn)物的合成有明顯的抑制作用。

本試驗(yàn)首先對(duì)生產(chǎn)上常使用的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了單因素的初篩，從中得出適合菌體生長(zhǎng)的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽，縮小了優(yōu)化的范圍，以便進(jìn)一步運(yùn)用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化。最后確定了咪唑乙煙酸降解菌Y的發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組合：麥麩皮2%，米糠2.5%，豆粕2%，酵母粉1%，NaCl 0.8%，CaCl20.6%，F(xiàn)eSO40.015%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基中各組分滿足原料取材方便，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉的原則，適于工業(yè)化生產(chǎn)的需要。本研究后續(xù)工作將對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]黃振剛,王鵬,劉云龍.除草劑藥害產(chǎn)生原因及防治技術(shù)的探討[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理,2008,29(3)∶50-51.

[2]Zhang W Q,Steven D,Linscombe.Risk assessment of the transfer of imazethapyr herbicide tolerance from clear field rice to red rice[J].Euphytica,2006,152∶75-86.

[3]蘇少泉.長(zhǎng)殘留除草劑對(duì)后茬作物安全性問(wèn)題[J].農(nóng)藥,1998,37(12)∶4-7.

[4]王學(xué)東,歐曉明,王慧利.除草劑咪唑煙酸高效降解菌的篩選及其降解性能的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(1)∶102-105.

[5]蘇少泉.除草劑在土壤中的降解與使用[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2004,3(1)∶5-8.

[6]劉亞光,馬超,龐福德.降解除草劑咪唑乙煙酸細(xì)菌的分離鑒定及生長(zhǎng)特性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(2)∶7-12.

[7]劉亞光,龐福德.咪唑乙煙酸高效降解菌降解性能的研究[J].植物保護(hù),2009,35(2)∶63-66.

[8]劉曉蘭,馮紅,鄭喜群,等.甜菜渣發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基成分的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2008(3)∶174-176.

[9]Aharonowitz Y.Nitrogen metabolite regulation of antibiotic biosynthesis[J].Annual Review of Microbiology,1980,34∶209-233.

[10]吳明霞,鄧靜,吳華昌,等.透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源,2008,30(1)∶37-40.