培養(yǎng)基添加物對馬鈴薯花藥褐化及愈傷誘導的影響

趙 欣，盧翠華，陳伊里，石 瑛，邸 宏，張麗莉，張正國，張 歡

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯是同源四倍體植物，基因分離復雜，隱性基因的表現(xiàn)頻率低，建立在四倍體水平上的雜種實生苗和無性系選擇的常規(guī)育種方法效率比較低。此外，馬鈴薯普通栽培種基因庫比較狹窄，而具有豐富基因的大量野生種質(zhì)資源約75%為二倍體，普通栽培種與其雜交受到倍性障礙而難以成功，限制了野生種質(zhì)中優(yōu)良基因的利用。因此，開展馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究對于優(yōu)良品種的選育和改良具有重要意義。

我國從20世紀80年代開始進行馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究，但是一直存在誘導率低、白化苗、混倍現(xiàn)象等問題，因此，一直沒能在馬鈴薯育種中得到廣泛應用[1-3]。馬鈴薯花藥培養(yǎng)受基因型、激素配比、溫度和甘露醇處理等因素的影響[4-5]，培養(yǎng)基中添加的硝酸銀、活性炭、馬鈴薯提取液也是影響花藥培養(yǎng)的重要因素。

本試驗以馬鈴薯栽培種（Solanum tuberosum L.）為材料，對培養(yǎng)基添加物硝酸銀、活性炭、馬鈴薯提取液進行研究，以期建立高效穩(wěn)定的馬鈴薯花藥培養(yǎng)體系，為馬鈴薯新品種的選育提供有效的育種途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以Vangal、波C、訥16、春薯4號和內(nèi)薯7號5個馬鈴薯品種（系）為材料，由大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山馬鈴薯研究所、東北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯研究室、內(nèi)蒙古呼盟農(nóng)業(yè)科學研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 花蕾的采集及花粉發(fā)育時期的檢測

2008年7月，在馬鈴薯盛花期采集長度約5～6 mm的花蕾，取蕾時間8：00～9：00 am，撕開花瓣，取出花藥（花藥長度3～4 mm），用卡諾固定液固定，采用醋酸洋紅染色，在40倍顯微鏡下觀察花粉的發(fā)育階段，選取小孢子處于單核靠邊期花藥，接種在培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

誘導培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D+1.0 mg·L-1KT+6%蔗糖+0.7%瓊脂；分化培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂。

1.2.3 消毒與接種

將花蕾用自來水沖洗10～20 min，在超凈工作臺上，用70%的酒精滅菌30 s，0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗3～4次，用鑷子取出花藥接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。接種密度為每100 mL三角瓶40個，每個處理5瓶。置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，待誘導出愈傷組織或胚狀體后，將其放于光下培養(yǎng)。光照 16 h·d-1，黑暗 8 h·d-1。

1.2.4 誘導培養(yǎng)基不同添加物的處理

1.2.4.1 硝酸銀處理

將內(nèi)薯7號和Vangal接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中分別添加10、20、30 mg·L-1的硝酸銀，以不加硝酸銀的為對照，30 d后統(tǒng)計褐化率及愈傷誘導率。

1.2.4.2 活性炭處理

將訥16和Vangal接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中分別添加0.25、0.50、0.75 g·L-1的活性炭，以不加活性炭為對照，30 d后統(tǒng)計褐化率及愈傷誘導率。

1.2.4.3 馬鈴薯提取液處理

將訥16、春薯4號、內(nèi)薯7號和波C接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中添加馬鈴薯提取液50 g·L-1，以不添加馬鈴薯提取液為對照，30 d后統(tǒng)計愈傷誘導率。

1.2.4.4 統(tǒng)計方法

褐化率（%）=褐化的花藥數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%

愈傷組織誘導率（%）=形成愈傷組織的花藥數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%

1.2.5 分化培養(yǎng)基的篩選

選用內(nèi)薯7號、訥16、波C和春薯4號的愈傷組織為試驗材料，轉(zhuǎn)入以下4種分化培養(yǎng)基。每個處理5瓶，置于光下培養(yǎng)，調(diào)查愈傷組織分化情況。

分化培養(yǎng)基如下：

A：MS+0.5 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

B：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

C：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

D：MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

1.2.6 再生植株根尖染色體倍性鑒定

再生植株在生根培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L-1NAA）中誘導生根，根長約1 cm時，7：00～8：00 am剪取根，洗去根上殘存的培養(yǎng)基，置于冰水混合物中預處理24 h，用固定液（95%乙醇：冰乙酸=3：1）固定24 h，取出根用蒸餾水沖洗3～4遍，用醋酸洋紅染色后制片，在100倍光學顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸銀對馬鈴薯花藥褐化及愈傷組織誘導的影響

培養(yǎng)基中加入適量的硝酸銀有助于減輕花藥的褐化程度。由表1可知，隨著硝酸銀濃度的增加，花藥的褐化率呈逐漸下降趨勢，各處理間差異顯著。內(nèi)薯7號和Vangal的變化趨勢基本一致，硝酸銀濃度從10 mg·L-1增加到30 mg·L-1時，褐化率分別從77.5%和89.5%分別降到67%和71%，且均低于對照。

試驗材料內(nèi)薯7號和Vangal，隨著硝酸銀濃度的增加，愈傷組織誘導率呈先升后降趨勢。當硝酸銀濃度為20 mg·L-1時愈傷組織誘導率達到最大值，分別為10.5%和8.0%，與10、30 mg·L-1及對照相比差異顯著。當硝酸銀濃度增加到30 mg·L-1時，愈傷組織誘導率分別降到7.0%和3.5%，仍高于對照，但差異不顯著。

表1 硝酸銀對花藥褐化率及愈傷組織誘導率的影響Table 1 Effect of silver nitrate on anther browning rate and callus induction rate

2.2 活性炭對馬鈴薯花藥褐化及愈傷組織誘導的影響

由表2可知，訥16和Vangal在加入活性炭的培養(yǎng)基中褐化率均顯著低于對照。隨著活性炭濃度的增加，花藥褐化率逐漸降低。其中訥16的褐化率從80%降到75%，Vangal從90%降到84%。

當活性炭濃度為0.50 g·L-1時，愈傷組織誘導率最高，訥16從原來的4.5%提高到11%，Vangal從原來的3.0%提高到8.0%，但當活性炭濃度增加到0.75g·L-1時，愈傷組織誘導率又分別降到7.5%和2.0%。Vangal的降幅較大，誘導率低于對照（見表 2）。

表2 活性炭對花藥褐化率及愈傷組織誘導率的影響Table 2 Effect of active carbon on anther browning rate and callus induction rate

2.3 馬鈴薯提取液對馬鈴薯花藥愈傷組織誘導的影響

由圖1可知，訥16、春薯4號、內(nèi)薯7號、波C這4份材料的愈傷組織誘導率均高于對照。其中波C的增幅較大，從0.5%提高到2.5%，提取液對其他3份材料的促進作用也非常明顯。因此，培養(yǎng)基中加入適量的馬鈴薯提取液能促進愈傷組織的誘導。

2.4 不同培養(yǎng)基對花藥分化的影響

利用新復極差法，對各培養(yǎng)基的出苗率在0.05水平下進行多重比較。由表3可知，愈傷組織在分化培養(yǎng)基A、B、C、D中均分化出苗，但各培養(yǎng)基間差異顯著，出苗率大小為：A＞B＞D＞C。培養(yǎng)基A的出苗率最高達15%，培養(yǎng)基C的出苗率最低為1.3%。

表3 不同的培養(yǎng)基對花藥愈傷組織分化的影響Table 3 Effect of different culture media on differentiation of callus

2.5 再生植株染色體倍性鑒定

利用根尖染色體計數(shù)法對所獲得的23株再生植株進行倍性鑒定。

由表4可知，雙單倍體植株（2n=24）15株，發(fā)生率為65.2%，三倍體植株（2n=36）3株，占總數(shù)的13%，四倍體5株，占21.7%。

表4 花藥再生植株的倍性Table 4 Ploidy of anther regenerated plants

3 討論與結(jié)論

適量的培養(yǎng)基添加物有利于馬鈴薯花藥培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1硝酸銀花藥愈傷誘導率最高，褐化率明顯降低；培養(yǎng)基中添加活性炭濃度為0.5 g·L-1時，效果最佳；添加5%的馬鈴薯提取液有利于馬鈴薯花藥誘導。

3.1 硝酸銀對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

許多研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，硝酸銀能促進單子葉及雙子葉植物愈傷組織的誘導及植株再生[6-12]。硝酸銀能夠促進愈傷組織產(chǎn)生的主要原因是硝酸銀能夠抑制乙稀的產(chǎn)生，延緩花藥褐化衰變所致。肖莉杰等認為硝酸銀在玉米愈傷組織的誘導及其質(zhì)量的提高方面有一定的作用[13]。張淑紅等發(fā)現(xiàn)，硝酸銀可抑制馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體的褐化，從而提高其細胞分裂頻率[14]。雖然硝酸銀對愈傷組織的誘導和分化有促進作用，但高濃度對植物細胞的生理代謝造成毒害，并導致畸形芽的形成。本研究表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，硝酸銀不僅可以促進愈傷組織的誘導還可防止褐化，這與前人的研究結(jié)果一致[13,15]。

3.2 活性炭對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

眾所周知，活性炭能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，但只是在一定的濃度范圍內(nèi)有促進作用，當超過一定量時，反而抑制愈傷組織的形成。這是由于活性炭的吸收作用無選擇性，在吸附培養(yǎng)基中有毒物質(zhì)的同時，也吸附培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與花藥培養(yǎng)密切相關(guān)的物質(zhì)，可能對花藥培養(yǎng)有抑制作用[16-18]。本試驗活性炭的濃度在0.25～0.50 g·L-1范圍內(nèi)有利于馬鈴薯花藥培養(yǎng)。

3.3 馬鈴薯提取液對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

利用天然植物提取液和多種類植物生長激素及生長物質(zhì)，如月光花素、落地生根汁液、雜交稻根提取液和水稻幼穗汁液等，以提高水稻花粉植株誘導率和綠苗分化頻率[19-20]。據(jù)報道，馬鈴薯提取液可大幅度提高植物花藥培養(yǎng)時愈傷組織及胚狀體的誘導率。戴朝曦研究證明5%的馬鈴薯提取液可明顯提高愈傷組織的誘導率[21]。本試驗結(jié)果與其一致，在誘導培養(yǎng)基中加入5%的馬鈴薯提取液有利于花藥培養(yǎng)。

3.4 再生植株倍性鑒定

染色體計數(shù)法是確定倍性最基本和最可靠的方法。在單倍體育種中，通過花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)及孤雌生殖等方法獲得的再生植株一般是單倍體、雙單倍體及其他倍性植株的混合群體。本試驗利用根尖染色體計數(shù)法對獲得的馬鈴薯再生植株進行了倍性鑒定，明確了各植株倍性。

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