硫素營養(yǎng)水平對大豆籽粒OAS-TL表達的影響

馬淑梅，劉麗君，孫聰姝，董守坤，祖 偉

（東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

硫是植物生長所必需的礦質營養(yǎng)元素，同碳、氮營養(yǎng)一樣，在植物代謝和生長發(fā)育過程中起著重要作用。大豆籽粒富含蛋白質，但含硫氨基酸含量很低，是大豆蛋白質營養(yǎng)價值的限制因子。研究大豆硫素代謝的關鍵酶，對深入了解大豆品質形成影響的關鍵位點，提高大豆含硫氨基酸含量具有重要意義。

半胱氨酸（Cys）作為硫代謝途徑中最初的還原硫化合物，是蛋氨酸、谷胱苷肽、輔基、維生素、硫脂等硫衍生物的合成前體，是維持蛋白質結構和活性的必要因素，體現了硫素的生理功能。氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶（O-acetyl-L-serine（thiol）-lyase，OAS-TL）和絲氨酸乙酰轉移酶（Serine acetyltransferase，SAT）以雙酶復合體的形式存在，通過構象變化共同催化OAS與S2+合成半胱氨酸[1-2]。其中，游離型OAS-TL起催化半胱氨酸合成的作用，該反應將硫代謝和氮代謝聯系起來，受硫素營養(yǎng)調控[3]。一般情況下，生物體會根據硫酸鹽還原途徑中硫化物的生成量來調節(jié)OAS的合成，并最終對整個硫素吸收和同化進行調控。在高等植物中，已經克隆到一族OAS-TL酶的cDNA，并且在大腸桿菌中進行了功能表達。在A.thaliana中發(fā)現了4個編碼OAS-TL的基因，分別命名為（oasA1、oasA2、oasB和oasC），分別編碼胞質型、線粒體型和葉綠體型OAS-TL[4-5]。目前，大部分關于OAS-TL活性及表達的研究都是外界條件短期內對室內培育植株刺激的影響，而室外盆栽種植條件下鼓粒期籽粒OASTL的研究少見報道，本試驗擬通過對大豆氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶的克隆及在硫素營養(yǎng)下表達的探索，為進一步研究硫素代謝同化調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

盆栽試驗品種選用東北春大豆品種東農46（高油型）和黑農35（高蛋白型）。

1.2 方法

1.2.1 大豆硫素營養(yǎng)處理

采用盆栽試驗，利用規(guī)格35 cm×15 cm的米氏盆，裝15 kg·盆-1土與砂的混合物（重量比1：1）以降低土壤基礎肥力，測定有效硫含量為9.3 mg·kg-1，在臨界值（16 mg·kg-1）以下，保證施硫效果。黑農35和東農46分別設3個施硫水平：低硫（S0）、中硫（S20）、高硫（S80），施入純硫量分別為 0、0.02、0.08 g·kg-1土；氮肥施入量為純氮 50 kg·hm-2；磷肥施入量為 75 kg·hm-2；鉀肥施入量為 50 kg·hm-2。硫肥采用硫磺粉；氮肥采用尿素；磷肥采用重過磷酸鈣；鉀肥采用氯化鉀，肥料作為基肥播種前一個月施入。硫磺粉經過氧化后，測得S20處理有效硫含量為19.7 mg·kg-1，S80處理有效硫含量為77.5 mg·kg-1。每盆播種5粒，定苗3株。每個處理重復40次。自鼓粒期開始取籽粒，每隔7 d取1次，共取4次。取樣時將每5株大豆10節(jié)和11節(jié)上的豆莢取下，撥開豆莢將籽粒取出，用氯仿擦拭混合后包于錫紙并存放于液氮中，最后轉移至超低溫冰箱。

1.2.2 OAS-TL活性測定

稱取籽粒0.5 g，置于預先冷凍過的研缽中，加入5 mL提取液，冰浴下研磨至勻漿，倒入離心管，4℃下14 000 r·min-1，離心 15 min。取上清 100 μL，加入 1.0 mL 反應液（100 mmol·L-1的 Tris-HCl，pH 8.0，內含 20 mmol·L-1的 OAS，1 mmol·L-1的Na2S），26℃水浴下反應10 min，終止后加入2.5 mL茚三酮溶液（250 mg茚三酮溶于10 mL冰醋酸：濃鹽酸（3：2）的溶液）中，沸水浴10 min后迅速冷卻，加入2 mL冷凍過的100%的乙醇并混合均勻，546 nm波長測定吸光值。以半胱氨酸做標準曲線，酶活單位為μmol·g-1FW·min-1，表示單位時間內每1 g鮮葉片產生的半胱氨酸量。每個樣品3個平行樣，3次重復[6]。

1.2.3 東農46籽?？俶RNA的提取及反轉錄合成cDNA

按照Trizol Reagent Invitrogen的試劑盒說明書提取東農46籽粒總RNA，采用紫外分光光度計測定樣品OD260/280值在1.8～2.0之間，用 1.5%瓊脂糖電泳檢測RNA無明顯降解后進行反轉錄。取RNA 2 μg按Prime ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒的操作方法，兩步法完成反轉錄，獲得cDNA模板，-20℃保存，用于PCR擴增。

1.2.4 OAS-TL的同源克隆

利用Primer Primer 5.0軟件，根據GenBank提供的大豆OAS-TL基因序列（Accession No.AF452 451）設計特異引物。上游引物OAS-TL-F：5′GCT TTGTAGTGAGCAGAT3′，下游引物 OAS-TL-R：5′ATCTGCTCACTACAAAGC3′，在 NCBI網站上進行Blast以保證引物的專一性后，由上海生工合成。PCR反應總體積為 20 μL，含10×酶反應緩沖液2μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10mmol·L-1）各 0.5 μL，反轉錄所得的 cDNA 0.5 μL，Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL。反應程序為 94 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72℃終延伸6 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0將目的片段回收純化，連接于克隆載體pMD18-T Vector（TaKaRa）上，質粒熱激轉化已制備好的感受態(tài)E.coli DH5α，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，將陽性菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日收集菌體，送至上海生物工程公司測序。將測序結果拼接，得到序列與GenBank數據庫進行生物信息學分析，采用DNAMAN6.0軟件對核酸序列分析及進化分析。

1.2.5 大豆籽粒RNA提取及反轉錄

方法同1.2.3，經紫外/可見光分光光度計將各處理RNA含量調到一致。

1.2.6 半定量RT-PCR

參照克隆得到的大豆OAS-TL cDNA序列進行半定量引物設計。上游引物OAS-TL-1-F：5′TTTG TTTCTGGGATAGGCACT3′，下游引物OAS-TL-1-R：5′CTCAAATAGCACGGAGGACAG3′，預期長度470 bp左右；內參參照大豆核糖體18S基因。上游引物 18S-F：5′AACCCCGACTTCTGGAAG3′，下游引物 18S-R：5′AACGGAATTAACCAGACAAA3′，預期長度1 100 bp左右。采用上述RCR體系，分別采用25、28和31個循環(huán)，確定指數擴增期，最后確定28個循環(huán)為宜。擴增18S基因，調整cDNA加入量，使擴增出來的條帶在瓊脂凝膠上看起來亮度一致。在28個循環(huán)條件下，擴增目的基因OAS-TL。取PCR產物2 μL，DNA marker 2 μL，1.5%瓊脂凝膠電泳檢測后凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

2 結果與分析

2.1 硫素營養(yǎng)對大豆籽粒OAS-TL的活性影響

自鼓粒期起每隔7 d取樣，研究硫素營養(yǎng)對大豆籽粒OAS-TL活性的影響，結果見圖1。鼓粒期大豆籽粒OAS-TL隨生育進程推進活性持續(xù)下降，高油品種東農46活性總體上大于高蛋白品種黑農35，硫素營養(yǎng)在第7、14天作用效果顯著，不同施硫處理間差異明顯。第7天時，S20處理顯著增加OAS-TL活性，東農46和黑農35 S20處理分別比對照高21%和15%，S80增活效果不明顯；在第14天，東農46和黑農35，S20處理分別比對照高31%和30%，S80增活效果不明顯；第21天和第28天時各處理活性差異不大。

2.2 大豆OAS-TL基因序列分析

2.2.1 大豆OAS-TL基因的擴增結果

以提取的東農46籽?？俁NA為模板（見圖2），反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，用克隆引物進行RT-PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳檢測見圖3。從電泳結果推測，克隆片段長度為1 000 bp左右。

2.2.2 目的片段序列測定及同源性分析

擴增產物經瓊脂凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化，連接于克隆pMD18-T Vector載體上，經PCR檢測為陽性克隆后，送至上海生物工程公司測序。測序結果顯示，克隆到的大豆氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶基因cDNA長度為1 059 bp，預測開放閱讀框架始于第58位堿基，終于第912位堿基，共編碼284個氨基酸。采用分子生物學信息分析軟件DNASTAR，預測該蛋白相對分子質量為28.49，等電點為5.45。OAS-TL類屬于一大類以磷酸吡哆醛為輔基的超基因家族（PALP）。由圖3可知，大豆OAS-TL氨基酸序列具有該保守功能區(qū)，N端存在保守結構域PXXSVKDR，其中賴氨酸（Lysine）是磷酸吡哆醛的結合位點（圖4中用括號已標注）。將得到的核酸序列登錄到NCBI網站上，用Blastn程序進行序列的同源性檢索發(fā)現東農46的OAS-TL核酸序列與其他物種同源性很高，與箭舌豌豆（Vicia sativa）、三葉草（Trifolium subterraneum）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、野生大豆（Glycine soja）親緣很近。

圖4 OAS-TL cDNA核酸序列和相應的氨基酸序列Fig.4 Sequence of nucleic acids and deduced amino acids sequence of OAS-TL cDNA

2.3 硫素營養(yǎng)對大豆OAS-TL基因的表達影響

取東農46和黑農35各處理籽粒cDNA經18S引物擴增調整模板濃度一致后，再以克隆到的大豆OAS-TL為模板設計特異引物，進行半定量PCR擴增及檢測。檢測結果見圖5、6?？芍?，18S表達穩(wěn)定，可以作為對照研究OAS-TL的表達情況。OAS-TL基因表達受發(fā)育的調控，其穩(wěn)定態(tài)mRNA表達在籽粒發(fā)育早期表達較強，隨成熟逐漸降低。不同處理下OAS-TL的表達有差異。在第7天時，東農46和黑農 35都表現為S20、S80處理高于對照處理，硫素長期匱乏導致OAS-TL的mRNA下調表達；在第14天時，黑農35 S20處理顯著高于對照和S80處理；東農46的S20、S80處理都高于對照，S80下mRNA最強。籽粒成熟后期硫缺乏效果解除。

3 討論與結論

氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶（OAS-TL）是半胱氨酸合成最后一步的關鍵酶，在半胱氨酸的合成調節(jié)中占據核心地位。本研究以東農46為材料，設計特異性引物，獲得一個編碼OAS-TL基因的cDNA序列，全長1 059 bp，ORF長855 bp，編碼284個氨基酸。該酶基因類屬于一類以磷酸吡哆醛為輔基的超基因家族（PALP），N端存在保守結構域PXXSVKDR，聚類分析表明，大豆OAS-TL基因與其他植物該基因高度同源。本研究另外采用2個品種黑農35和東農46，設置了3個硫水平，研究硫素營養(yǎng)對OAS-TL表達的影響。結果表明：①2個品種籽粒OAS-TL活性表現為S20高于S0和S80處理；鼓粒前期施硫效果大于后期。②RT-PCR顯示OAS-TL穩(wěn)定態(tài)mRNA表達在籽粒發(fā)育早期表達較強且處理間差異明顯，發(fā)育后期表達水平逐漸降低。不同硫素處理間OAS-TL的表達有差異，總體上S20上調表達明顯。

按照植物硫營養(yǎng)調控中的需求所驅動的（Demand-driven）原理，硫供應在正常水平下，硫同化途徑受到抑制，當植物處于需求狀態(tài)且土壤環(huán)境中硫營養(yǎng)供給源不足時，上調硫營養(yǎng)吸收轉運與同化代謝水平，既OAS-TL基因表達應上調以促進代謝平衡。但在本研究中，硫素匱乏降低了兩種類型大豆籽粒鼓粒初期OAS-TL的活性及穩(wěn)定態(tài)mRNA的表達，這與之前的假說有很大的不同。原因可能是大豆植株缺硫的狀態(tài)經過苗期、花期，一直持續(xù)到鼓粒期，長期的硫素匱乏抑制了硫代謝網絡在植物細胞內多基因和多通路的調節(jié)機制，降低了OAS-TL的活性與表達，本研究與Hirai等研究結果一致[7]。

硫素代謝受發(fā)育的調控，即在較嫩的籽粒中mRNA表達高于成熟的籽粒，硫素缺乏和過量對各基因mRNA表達的影響在此時明顯，而隨著籽粒的成熟，mRNA表達下降，伴隨應答反應消失[8-9]。本研究中OAS-TL活性及基因表達在籽粒發(fā)育前期較強，后期逐漸下降，這種表達的發(fā)育調控模式顯示硫同化主要發(fā)生在生長活躍的組織中，需要大量的半胱氨酸和甲硫氨酸來進行蛋白質的合成，而成熟的籽粒中積累的硫酸根在后期的發(fā)育中起到了緩沖的作用。

[1]Droux M,Douce R,Job D,et al.Interactions between serine acety ltransferase and O-acetyl-L-serine(thiol)-lyase in higher plants structural and kinetic properties of the free and bound enzyme[J].Eur J Biochem,1998,255∶235-245.

[2]Wirtz M,Berkowitz O,Droux M,et al.The cysteine synthase complex from plants.Mitochondrial serine acetyltransferase from Arabidopsis thaliana carries a bifunctional domain for catalysis and protein-protein interaction[J].Eur J Biochem,2001,268∶686-693.

[3]Kim H,Hayashi M Y,Chino M,et al.Role of O-acetyl-L-serine in coordinated regulation of the expression of a soybean seeds storage protein gene by sulfur and nitrogen nutrition[J].Planta,1999,209(3)∶282-289.

[4]Hesse H,Altmann T.Molecular cloning of cysteine synthases cDNA from Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiol,1995,108∶851-852.

[5]Hell R,Jost R,Berkowitz O,et al.Molecular and biochemical analysis of a the enzymes of cysteine biosynthesis in the plant Arabidopsis thaliana[J].Amino Acids,2002,22(3)∶245-257.

[6]Demosthenis C,Krishnan B.Sulfur assimilation in soybe-an∶Molecularcloningandcharacterization ofO-acetyl-L-serine(thiol)-lyase(cysteinesynthase)[J].CropScience,2003,43∶1819-1827.

[7]Hirai M Y,Fujiwara T,Awazuhara M,et al.Global expression profiling of sulfur-starved Arabidopsis by DNA macroarray reveals the role of O-acetyl-L-serine as a general regulator of gene expression in response to sulfur nutrition[J].Plant,2003,33∶651-663.

[8]Leustek T,Martin M N,Bick J A,et al.Pathway and regulation of sulfur metabolism revealed through molecular and genetic studies[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2000,51∶141-165.

[9]Blake-Kalff M M A,Harrison K R,Hawkesford M J,et al.Distribution of sulfur within oilseed rape leaves in response to sulfur deficiency during vegetative growth[J].Plant Physiol,1998,118∶1337-1344.