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    同型半胱氨酸促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化*

    2010-08-02 13:04:36王生蘭劉輝琦曹學(xué)鋒
    中國病理生理雜志 2010年7期
    關(guān)鍵詞:平滑肌表型半胱氨酸

    王生蘭,劉輝琦,曹學(xué)鋒,劉 杰, 吳 穹

    (青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,青海 西寧 810001)

    血管平滑肌細(xì)胞 (vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、血管成型術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近年來大量研究表明,高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥是造成AS的獨立的危險因素,在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2],其主要分子機(jī)制至今仍不清晰,Hcy促平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)被認(rèn)為是其促AS的機(jī)制之一[3,4]。但Hcy對 VSMCs表型轉(zhuǎn)化是否有影響少見文獻(xiàn)報道。本研究探討Hcy對VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)化的影響,為闡明Hcy致AS的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

    材料和方法

    1 材料

    SD大鼠由蘭州大學(xué)動物中心提供;Ⅰ型膠原酶(collagenaseⅠ)購自 Sigma;胰蛋白酶(trypsin)、DEME/F12干粉狀培養(yǎng)基購自Gibco-BRL;Transzol總RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RT-PCR兩步法試劑盒購自TaKaRa;四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自Sigma;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;PCR擴(kuò)增引物由Invitrogen合成。

    2 大鼠VSMCs的體外培養(yǎng)、鑒定和分組

    采用酶消化法分離培養(yǎng)。純種雄性SD大鼠,體重180-220 g,無菌條件下分胸腹主動脈,移入超凈臺,刀背刮去內(nèi)膜,從外膜上撕下中膜,用Ⅰ型膠原酶消化分離 VSMCs。用 DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(濕度100%)內(nèi)靜置進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,并做α-actin肌動蛋白免疫組化檢測。取3-6代細(xì)胞用于實驗,將細(xì)胞分別置于終濃度為 0、50、100、200、500和1000 μmol/L Hcy的培養(yǎng)液中孵育24 h。

    3 細(xì)胞增殖的MTT實驗檢測

    分別收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,用胰酶消化,制成細(xì)胞懸液 (5 ×1012cells/L),加入96孔培養(yǎng)板,每孔200 μL,置 5%CO2、37 ℃ 的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng) 24 h后,吸出培養(yǎng)液,分別按分組設(shè)計加入Hcy液,培養(yǎng)24 h后,每孔加入 20 μL MTT(5 g/L),置 5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中作用 4 h,除去上清液,加入150 μL DMSO溶解,平板振蕩儀振蕩10 min,酶聯(lián)免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。

    4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

    細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液,1000 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗滌2次,加入磷酸鹽緩沖液PBS 0.5 mL混懸細(xì)胞。用4#注射針頭將細(xì)胞打入4℃預(yù)冷的盛有乙醇的離心管中(乙醇終濃度為70%)固定,4℃冰箱保存。染色前用PBS洗滌,去除固定液。PI染色,4℃避光30 min,上機(jī)檢測。

    5 RT-PCR法檢測平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)mRNA 的表達(dá)

    收集各組細(xì)胞,用Transzol總RNA抽提試劑盒抽提總RNA。取各組細(xì)胞的總RNA各1 μg,按RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)(PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min,94 ℃1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,擴(kuò)增30 個循環(huán)。每份樣本以L19作為內(nèi)參照。引物序列:SM22α(平滑肌 22α,311bp)[5],正義鏈 5'- AAG CCA GTG AAG GTG CCT GAG -3',反義鏈 5'- TTG AAG GCC AAT CAC GTG CTT-3';L19(ribosomal protein,核糖體蛋白,內(nèi)參照,194 bp),正義鏈5'-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG -3',反義鏈5'-GGA CAG AGT CTT GAT GAT CTC-3'。反應(yīng)后取終產(chǎn)物5 μL在1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳分析,紫外線照像。

    6 透射電鏡觀察VSMCs形態(tài)學(xué)改變

    細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,倒去胰酶,用血清終止消化,PBS洗細(xì)胞2次,加10 mL PBS吹打制成細(xì)胞懸液,移至離心管中,用1500-2000 r/min離心15 min,棄上清,用吸管沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛,4℃靜置30 min,用12000 r/min離心15 min,棄上清,用吸管沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液固定后,常規(guī)透射電鏡樣本處理及透射電鏡觀察。

    7 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 Hcy對VSMCs增殖的影響

    1.1 Hcy對VSMCs活力的影響 MTT檢測顯示,不同濃度Hcy作用24 h,隨Hcy濃度增加VSMCs細(xì)胞存活率升高,200 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L Hcy組與對照組(0 μmol/L)相比,差異顯著(P<0.05),見表1。

    表1 Hcy對VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

    表1 Hcy對VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

    *P <0.05 vs control group.

    Hcy(μmol/L) A value Cell viability(%)00.0867 ±0.0567 100.0050 0.1117 ±0.0548 128.84100 0.1045 ±0.0515 120.53200 0.1340 ±0.0477 154.56*500 0.1578 ±0.0375 182.01*1000 0.1484 ±0.0565 176.16*

    1.2 Hcy對VSMCs細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測分析顯示,0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy作用 VSMCs 24 h,G0/G1期細(xì)胞逐漸減少(75.60±8.71、75.23 ±0.41、68.20 ±3.52、68.03 ±6.75、65.27 ±7.11、37.73±3.87),S期細(xì)胞逐漸增多(23.73 ±9.05、20.47 ±5.19、21.23 ±8.51、29.93±10.23、31.80 ±7.45、61.13 ±3.61),見圖1。

    Figure1.Cells in G0/G1stage decrease and in S stage increase with the raising of DNA synthesis affected by Hcy at different concentrations for 24 h.圖1 Hcy對VSMCs細(xì)胞周期的影響

    2 Hcy對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

    2.1 Hcy對VSMCs SM22α mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,隨Hcy濃度增大,SM22α mRNA表達(dá)減少,Hcy 1000 μmol/L 組與對照組相比(0 μmol/L)差異顯著(P <0.01),見圖2。

    Figure2.Effect of Hcy on VSMCs SM22α mRNA expression in VSMCs..n=3.**P<0.01 vs control(0 μmol/L)group.圖2 Hcy對VSMCs SM22α mRNA表達(dá)的影響

    2.2 Hcy對VSMCs超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡結(jié)果顯示,對照組血管平滑肌細(xì)胞為梭形,細(xì)胞內(nèi)可見豐富的肌絲,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器較少,主要分布于核兩端;200 μmol/L Hcy作用24 h后,細(xì)胞變圓,胞內(nèi)肌絲不明顯,核周圍有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體,核大,染色質(zhì)疏松,見圖3。

    Figure3.Transmission electron microscope revealed contractile phenotype which is plentiful myofilaments,small nucleus,compact chromatin in control group(A)(EM,×10000)and showed synthetic phenotype,which is abundant mitochondrion,rough endoplasmic reticulum and Golgi's complex,puffy chromatin,loose nucleus in VSMCs treated with Hcy at a concentration of 200 μmol/L for 24 h(B)(EM,×4000).圖3 Hcy對VSMCs超微結(jié)構(gòu)的影響

    討 論

    近年來大量研究表明,Hcy血癥是造成AS的獨立的危險因素,在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2],關(guān)于高Hcy血癥誘發(fā)AS的機(jī)制尚未完全明了。

    在AS形成過程中,動脈中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移,其表型和基因表達(dá)均發(fā)生明顯改變,參與細(xì)胞間質(zhì)合成,脂質(zhì)沉積,斑塊鈣化,并導(dǎo)致血管管壁增厚,因此平滑肌細(xì)胞在AS病變形成和發(fā)展中起重要作用[5]。Hcy與血管平滑肌細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。Tsai等[6]用與臨床高Hcy相應(yīng)的劑量作用于離體培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞,結(jié)果表明,Hcy可明顯促進(jìn)DNA合成,最大程度達(dá)4.5倍,同時可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白cyclinA及cyclinD mRNA表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期,從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。本研究顯示,隨Hcy濃度增高,VSMCs細(xì)胞存活率逐漸增加,同時G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低,而S期細(xì)胞比例明顯升高,DNA合成增加,表明 Hcy可促進(jìn)VSMCs增殖。

    VSMCs具有收縮型和合成型2種表型[7],細(xì)胞表型決定了細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能,正常VSMCs是收縮型,VSMCs表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是其增生的先決條件。平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)蛋白,又稱轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin),是一個22 kD的細(xì)胞骨架蛋白,其功能涉及血管平滑肌細(xì)胞的收縮調(diào)節(jié),被認(rèn)為是收縮表型的標(biāo)志物之一[8]。電鏡下,典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應(yīng)具有明顯的形態(tài)、結(jié)構(gòu)區(qū)別。前者核小、染色質(zhì)致密,胞漿富含收縮蛋白、肌絲,而較少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等合成、分泌性細(xì)胞器。而后者則核大、染色質(zhì)疏松,少肌絲,但卻富含合成、分泌性細(xì)胞器[9]。本實驗中,不同濃度Hcy作用下SM22α的表達(dá)下調(diào),Hcy濃度增至1000 μmol/L時差異顯著。同時200 μmol/L Hcy作用24 h后,VSMCs細(xì)胞中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯增多,胞核大、染色質(zhì)疏松,呈現(xiàn)合成表型的特征。因此,本研究顯示,同型半胱氨酸在促進(jìn)VSMCs增殖的同時可促進(jìn)其表型轉(zhuǎn)化。

    絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是引起細(xì)胞增殖反應(yīng)的細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路,通過磷酸化而活化,Woo等[10]實驗發(fā)現(xiàn)臨床高Hcy刺激牛平滑肌細(xì)胞增殖,且用MAPK磷酸化抑制劑可抑制Hcy誘導(dǎo)的MAPK磷酸化及平滑肌細(xì)胞增殖,說明Hcy刺激牛平滑肌細(xì)胞增殖的過程中包含了MAPK磷酸化的激活。VSMCs的表型轉(zhuǎn)換受一系列復(fù)雜的信號分子和環(huán)境因素整合效應(yīng)的影響。Karra等[11]研究顯示,可能有數(shù)百個基因的改變參與了表型轉(zhuǎn)換和AS的早期進(jìn)展,涉及表型轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因多為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因,而涉及 AS早期進(jìn)展的基因則多與脂質(zhì)代謝相關(guān)。目前最受人關(guān)注的順式調(diào)控元件為CArG,CArG元件的啟動幾乎為SMCs所有分化標(biāo)志基因的表達(dá)所必需。該序列是轉(zhuǎn)錄因子血清反應(yīng)因子(serum response factor,SRF)的結(jié)合位點,SRF與 CArG的結(jié)合即激活一些早期基因促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖,如 c-fos;也激活促進(jìn)細(xì)胞分化的基因,如 SM-αactin、SM-MHC和肌動蛋白相關(guān)蛋白(SM22-actin,SM22 α)等。Owens等[12]發(fā)現(xiàn),凝血酶和胎牛血清在引起SMCs增殖的同時并不影響 VSMCs的 SM-α-actin等分化基因的表達(dá)。Su等[13]在觀察活性氧對VSMCs分化的調(diào)節(jié)機(jī)制時發(fā)現(xiàn),活性氧通過p38MAPK信號通路促進(jìn) VSMCs的分化。因此,SMCs增殖的調(diào)控與 SMCs分化、或表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控雖然緊密相關(guān),但并不完全呈此消彼長的關(guān)聯(lián)方式。同型半胱氨酸引起VSMCs表型轉(zhuǎn)化是否通過MAPK通路,其分子機(jī)制如何,有待進(jìn)一步研究。

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