蛇床子素內(nèi)酯環(huán)完整性對抑真菌活性的影響

蘭樹敏 ，梅清華 ，林敬明 ，龔文菲 ，林茂銳

（1.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東廣州 510317；2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣東廣州 510282）

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床[Cnidium monnieri（L）Cuss]的干燥成熟果實，性溫，有小毒，外用燥濕殺蟲止癢，內(nèi)服溫腎壯陽，祛風燥濕[1]，是常用外用中藥。其主要成分蛇床子素（osthole）藥理活性廣泛，在皮膚的作用主要有抑制過敏（止癢），對細菌、真菌和病毒都有殺滅和抑制作用[2-4]。osthole分子結(jié)構(gòu)中有一個內(nèi)酯環(huán)，有研究指出[5]，pH=5以上會導致內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，從而失去抑真菌活性，但具體影響未見報道。本實驗比較了該內(nèi)酯環(huán)開環(huán)前后osthole對臨床淺部真菌病主要致病菌須毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌的抑菌活性，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 須毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌實驗菌株均為珠江醫(yī)院臨床分離株。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和沙氏培養(yǎng)基，按照說明配制，115℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.1.2 供試品溶液制備 取osthole 0.5 g，加50 ml乙醇，溶解，加甘油 50 ml，吐溫-8010 ml，加水稀釋至 500 ml，攪拌均勻，分出2瓶，各100 ml，分別調(diào) pH值，一瓶以鹽酸溶液（9→1000）調(diào)整pH值至4.0，另一瓶用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至9.0，得0.1%osthole溶液。同法制備不含osthole的兩種pH值空白溶液，均以0.25 μm微孔濾膜行無菌濾過，即得。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備[6]取須毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌，28℃用PDA活化7 d，在菌落上加入含有0.01 ml吐溫-20的0.85%氯化鈉溶液1 ml，得菌懸液。靜置3～5 min，待大顆粒沉于底部，取上層均質(zhì)液體至無菌小管，振蕩15 s，用比濁儀測定菌懸液濃度，調(diào)整至3×106cfu/ml，以生理鹽水稀釋10倍，得終濃度為3×105cfu/ml的接種液。

1.2.2 接種及培養(yǎng) 取無抗性的PDA固體培養(yǎng)基，均勻涂布接種液，放置含200 μl各相應(yīng)供試品溶液的濾紙片（直徑:10 mm），每種供試品溶液平行做3份，28℃培養(yǎng)5 d。取出，量取抑菌圈直徑。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 組間比較采用t檢驗，均以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

培養(yǎng)后量取的抑菌圈直徑見表1。

osthole溶液pH=4.0與pH=9.0相比，對須毛癬菌的抑菌圈直徑前者大于后者，有極顯著性差異（P＜0.01），對紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌則沒有區(qū)別（P＞0.05）?？瞻兹芤簆H=4.0與pH=9.0相比，對三種真菌的抑菌圈直徑后者均大于前者，對須毛癬菌和紅色毛癬菌有極顯著性差異（P＜0.01），對石膏樣小孢子菌有顯著性差異（P＜0.05）。osthole溶液與空白溶液相比，當pH=4.0時，前者對三種真菌的抑菌圈直徑均遠大于后者（P＜0.01）；pH=9.0時，對須毛癬菌的抑菌圈直徑兩者沒有區(qū)別，對紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌則osthole溶液遠大于空白溶液（P＜0.01）。

表1 不同pH osthole溶液對常見淺部真菌抑菌活性Tab.1 The antifungal activity of osthole solution with different pH to superficial mycosis

3 討論

osthole溶液在pH=5以上時內(nèi)酯環(huán)會開環(huán)，本實驗分別配制pH=4.0和pH=9.0的溶液，前者內(nèi)酯環(huán)保持完整，后者內(nèi)酯環(huán)被破壞。通過比較兩者對臨床淺部真菌病主要致病菌的抑菌圈直徑大小，可以初步觀察osthole內(nèi)酯環(huán)完整性對其抑真菌活性的具體影響。

osthole在水中幾乎不溶，本實驗采用的是乙醇∶甘油∶吐溫-80∶水（50∶50∶10∶390）的混合溶媒，配制 0.1%的溶液時溶解過程比較容易。鑒于溶媒中含有一定濃度的乙醇（10%），且pH相差較大，為避免影響實驗結(jié)果，在比較不同pH值的osthole溶液抑菌活性時，同時考察了兩種pH溶媒的抑菌活性。

須毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌是臨床淺部真菌病主要致病菌[7-8]，pH=4.0的空白溶液對三者均沒有表現(xiàn)出任何抑菌活性。但pH=9.0的空白溶液對三者均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，尤其對須毛癬菌，抑菌活性與相同pH的osthole溶液相當。這說明，堿性環(huán)境對真菌有一定的抑制作用，但對不同的真菌，抑制作用強度有區(qū)別，須毛癬菌和紅色毛癬菌對堿性環(huán)境敏感，而石膏樣小孢子菌則影響很小。

對須毛癬菌而言，pH=9.0的osthole溶液與pH=9.0的空白溶液抑菌圈直徑幾乎相當（22 mm∶21 mm，P＞0.05），都比pH=4.0 osthole溶液（32 mm）的抑菌圈直徑小很多，說明osthole內(nèi)酯環(huán)被破壞后抑菌活性完全喪失。對紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌而言，雖然pH=9.0的空白溶液有一定的抑菌作用，但比同pH的osthole溶液要弱很多（抑菌圈直徑對比，P＜0.01），而兩種pH的osthole溶液抑菌圈直徑幾乎相當（抑菌圈直徑對比，P＞0.05），說明osthole內(nèi)酯環(huán)被破壞后抑菌活性不受影響。

綜上所述，osthole對常見臨床淺部真菌病主要致病菌均有較好的抑制作用，其分子中內(nèi)酯環(huán)的完整性與此抑制作用沒有必然的聯(lián)系，視乎具體菌種會有絕然不同的效果。內(nèi)酯環(huán)被破壞后，可能完全喪失抑菌活性（如須毛癬菌），亦可能完全沒有影響（如紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌）。由于堿性環(huán)境恰好對須毛癬菌有較好地抑制作用，就osthole而言，堿性環(huán)境下，內(nèi)酯環(huán)被破壞對其抗淺部真菌病主要致病菌作用影響不大。

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