小鼠Lewis肺癌細(xì)胞Foxp3的表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制①

歷 春 蓋曉東 賈 婷 付海英 李 一 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,長春130021)

Foxp3(forkhead box P3)屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)特異性的表面標(biāo)志和發(fā)育及功能的決定因素[1,2]。Tregs是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群,在維持機(jī)體自身耐受過程中具有重要作用[3,4]。此外,Tregs還參與腫瘤的免疫逃逸,在腫瘤組織及腫瘤患者外周血中均檢測(cè)到Foxp3的高表達(dá)[5-7]。最新研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在胰腺癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)[8-13],而腫瘤細(xì)胞表達(dá)Foxp3是否與腫瘤的免疫逃逸相關(guān)尚不明確。因此,為了研究腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Foxp3是否參與腫瘤的免疫逃逸,本研究檢測(cè)小鼠Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞Foxp3的表達(dá),構(gòu)建pcDNA3.1-Foxp3真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染小鼠LLC細(xì)胞,檢測(cè)Foxp3過表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖和TGF-β1、IL-10表達(dá)的影響,探討LLC 細(xì)胞中Foxp3表達(dá)在腫瘤免疫逃逸中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(Invitrogen公司);膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 、Ex Taq DNA 聚合酶 、T4 DNA 連接酶 、DNA marker、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均為Takara公司產(chǎn)品;Foxp3單克隆抗體(eBiscience公司)、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司;FuGENE HD(Roche);TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒均購自武漢博士德公司;刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供C57BL/6小鼠7只,雌性,4～6周齡,體重18～22克。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠LLC細(xì)胞用含10%新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,PCR儀擴(kuò)增目的基因片段。Foxp3引物為:上游:5′-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3′;下 游 :5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃2分鐘,(變性94℃30秒,退火 60℃30秒,延伸72℃1分鐘),共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為 382 bp。TGF-β1引物為:上游 :5′-GCCCTGGATACCAACTATTGC-3′;下 游 :5′-GCAGGAGCGCACAATCATGTT-3′。擴(kuò)增條件 :預(yù)變性94℃2分鐘,變性 94℃30秒,退火58℃30秒,延伸72℃1分鐘,共進(jìn)行26個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為 360 bp。IL-10引物為:上游:5′-GCTCTTACTGACTGGCAT-3′;下 游:5′-GGCCTTGTAGACACCTTGGT-3′。擴(kuò)增條件:預(yù)變性 94℃2分鐘,變性94℃30秒,退火56℃30秒,延伸 72℃1分鐘,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為 440 bp。內(nèi)參 β-actin 引物為:上游:5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′;下游 5′-TAAAAC GCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃2分鐘,(變性 94℃30秒,退火52℃30秒,延伸72℃1分鐘),共進(jìn)行25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物為320 bp。引物由上海生工有限公司合成。

1.5 免疫組化檢測(cè)LLC細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá) LLC細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌,冷丙酮固定10分鐘,PBS清洗后加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑15分鐘,PBS清洗后加血清室溫封閉30分鐘,加大鼠抗小鼠Foxp3(1∶100),并用PBS做陰性對(duì)照,于4℃冰箱孵育過夜。次日用PBS清洗,加羊抗大鼠IgG(1∶100)室溫孵育40分鐘,PBS清洗后加DAB顯色5分鐘,用自來水沖洗3分鐘終止反應(yīng),然后依次進(jìn)行蘇木素襯染、鹽酸水化及封固。每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取300個(gè)細(xì)胞,著色強(qiáng)度分為:不著色(-);淺黃色(+);黃色(++);棕黃色(+++)。將結(jié)果按下列公式計(jì)算:Foxp3蛋白表達(dá)積分=(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3。

1.6 pcDNA3.1-Foxp3真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 Trizol試劑提取小鼠脾細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,擴(kuò)增Foxp3全長開放讀碼框。根據(jù)GeneBank中小鼠Foxp3的mRNA基因全序列(AY357712)設(shè)計(jì)引物,功能片段約為1300 bp。上游引物為5′-CCA ATG CCC AACCCT AGG C-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),下游引物為 5′-CAGT CTC GAG TCAAGGGCA GGGATT GGAGCA C-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用EcoRⅠ和XhoⅠ作雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收并純化產(chǎn)物,T4 DNA連接酶連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,涂板篩選陽性克隆。陽性克隆用EcoRⅠ/XhoⅠ作雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及DNA測(cè)序鑒定。

1.7 FuGENE HD介導(dǎo)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24小時(shí),消化LLC細(xì)胞,細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種六孔板。實(shí)驗(yàn)分3組:LLC組,pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組。轉(zhuǎn)染當(dāng)日,細(xì)胞達(dá)到80%融合。轉(zhuǎn)染前1小時(shí)各組均更換新鮮完全培養(yǎng)液,pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組分別取2μg質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1及pcDNA3.1-Foxp3),加入無血清的DMEM培養(yǎng)液至總體積為100μl,輕輕混勻,室溫放置。分別取FuGENE HD 6μl,加入上述DNA稀釋液中,輕輕混勻,室溫放置15分鐘后將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻,分別逐滴加入 pcDNA3.1-LLC組及 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組培養(yǎng)液中,輕輕混勻培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.8 C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 將C57BL/6小鼠斷髓處死,無菌取脾臟,研磨后用淋巴細(xì)胞分離液分離,收集中間乳白色層制成脾淋巴細(xì)胞懸液,用PBS洗滌2次,離心(1 500 r/min,5分鐘),重新懸浮于PBS,計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞濃度。

1.9 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響 分別取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后 LLC組、pcDNA3.1-LLC組及 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細(xì)胞以1×104個(gè)/孔(100μl)接種96孔板中,待細(xì)胞貼壁后加入絲裂霉素C至終濃度25 μg/ml,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)。以1×105個(gè)細(xì)胞/孔(100μl)的密度將脾淋巴細(xì)胞接種于已接種LLC細(xì)胞的96孔板中,同時(shí)設(shè)單純淋巴細(xì)胞組作為對(duì)照組,DMEM培養(yǎng)液作為空白調(diào)零,以ConA(終濃度5 mg/L)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,每組5個(gè)復(fù)孔。

收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的培養(yǎng)上清,置于96孔培養(yǎng)板,每孔100μl。加入分離的脾淋巴細(xì)胞懸液100μl(1×105個(gè)細(xì)胞)/孔,分組同上,以ConA(終濃度5 mg/L)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,每組5個(gè)復(fù)孔。

以上各孔均于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí);每孔加MTT溶液至MTT終濃度為0.5mg/ml,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí);每孔加入DMSO 150μl,震蕩 10分鐘;使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值,檢測(cè)波長為570 nm。淋巴細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.10 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中TGF-β1和IL-10的濃度 分別取LLC組、pcDNA3.1-LLC組和pcDNA3.1-Foxp3-LLC組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的培養(yǎng)上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),參照試劑盒說明檢測(cè)其中分泌的TGF-β1和IL-10蛋白含量,檢測(cè)波長為450 nm。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 LLC細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá) 為了證實(shí)Foxp3在LLC細(xì)胞中的表達(dá),首先采用RT-PCR方法從基因水平對(duì)LLC細(xì)胞進(jìn)行Foxp3 mRNA的檢測(cè),結(jié)果顯示2個(gè)LLC細(xì)胞樣本在382 bp處均有目的條帶出現(xiàn),與陽性對(duì)照脾細(xì)胞Foxp3條帶相符,但沒有脾細(xì)胞表達(dá)強(qiáng);陰性對(duì)照NIH-3T3細(xì)胞無Foxp3 mRNA表達(dá);初步表明小鼠LLC細(xì)胞表達(dá)Foxp3。見圖1。

2.2 LLC細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步證實(shí)LLC細(xì)胞中Foxp3在蛋白水平的表達(dá),對(duì)LLC細(xì)胞進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示,Foxp3蛋白在LLC細(xì)胞中呈陽性表達(dá),表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色均勻細(xì)顆粒,但著色較淺,見圖2。此結(jié)果進(jìn)一步證明LLC細(xì)胞表達(dá)Foxp3。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3的構(gòu)建

2.3.1 Foxp3全長基因的擴(kuò)增結(jié)果 為進(jìn)一步研究Foxp3在LLC細(xì)胞表達(dá)的可能作用,構(gòu)建pcDNA3.1-Foxp3重組質(zhì)粒。首先擴(kuò)增小鼠Foxp3全長基因。結(jié)果小鼠脾細(xì)胞總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳顯示在約1.3 kb處可見一明顯擴(kuò)增條帶,與Foxp3全長基因片段長度相符,見圖3。

2.3.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3的酶切電泳鑒定 為鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3,采用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切電泳鑒定。經(jīng)雙酶切的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3和pcDNA3.1空質(zhì)粒分別電泳后,前者出現(xiàn)了1.3和5.4 kb兩條帶(1.3 kb為Foxp3 cDNA產(chǎn)物,5.4 kb為pcDNA3.1線狀質(zhì)粒),而pcDNA3.1空質(zhì)粒則只有5.4 kb一條帶,初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖4。

圖1 Foxp3 mRNA在LLC細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 The expression of Foxp3 mRNA in LLC cells

圖2 免疫組化結(jié)果顯示LLC細(xì)胞表達(dá)Foxp3蛋白(×400)Fig.2 The expression of Foxp3 protein in LLC cells by IHC

圖3 Foxp3的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis result of Foxp3 PCR products

圖4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3酶切后的電泳鑒定Fig.4 Enzyme-cutting identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-Foxp3 by EcoRⅠand XhoⅠ

圖5 pcDNA3.1-Foxp3轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞后Foxp3 mRNA的表達(dá)水平Fig.5 The expression level of Foxp3 mRNA in LLCcells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3

2.3.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3的測(cè)序鑒定 為進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒為pcDNA3.1-Foxp3,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序,結(jié)果證實(shí)所克隆的基因?yàn)樾∈驠oxp3。

2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞48小時(shí)后Foxp3 mRNA的表達(dá) 為證實(shí)轉(zhuǎn)染后Foxp3的高表達(dá),采用RT-PCR方法從基因水平對(duì)LLC細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3 mRNA表達(dá)較LLC組和pcDNA3.1-LLC組明顯增強(qiáng)(P＜0.01),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組中Foxp3mRNA表達(dá)之間無明顯差異(P＞0.05)。見圖5、6,結(jié)果證明LLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Foxp3后Foxp3基因表達(dá)上調(diào)。

圖6 pcDNA3.1-Foxp3轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞后Foxp3 mRNA的表達(dá)水平Fig.6 The expression level of Foxp3 mRNA in LLC cells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3

圖7 pcDNA3.1-Foxp3轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞后Foxp3蛋白的表達(dá)水平(×400)Fig.7 Theexpression level of Foxp3 protein in LLC cells after transfected with pcDNA3.1-Foxp3(×400)

2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后LLC細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步證實(shí)Foxp3基因是否成功轉(zhuǎn)入LLC細(xì)胞,對(duì)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示,LLC組和pcDNA3.1-LLC組Foxp3蛋白著色較淺,且較均勻;而pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白的著色較深,且深淺不一,見圖7。LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白表達(dá)積分分別為(184.7±4.73)%、(188.6±5.68)%及(221.7±7.64)%。pcDNA3.1-Foxp3-LLC組Foxp3蛋白表達(dá)積分與LLC組和pcDNA3.1-LLC組比較差異有顯著性(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組中Foxp3蛋白表達(dá)之間無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果提示pcDNA3.1-Foxp3被成功導(dǎo)入LLC細(xì)胞,并能高表達(dá)Foxp3蛋白。

2.6 轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響 為研究LLC細(xì)胞Foxp3對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響,采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),將轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞及其上清分別與ConA刺激下的脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果顯示,LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的LLC細(xì)胞及其上清均可使T淋巴細(xì)胞的增殖受到抑制,且 pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的LLC細(xì)胞及其上清對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著,與LLC組和pcDNA3.1-LLC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組之間無明顯差異(P＞0.05),見表1、表2。以上結(jié)果提示LLC細(xì)胞中的Foxp3可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖,其作用方式可能是通過細(xì)胞接觸的方式或促進(jìn)某種細(xì)胞因子的分泌而實(shí)現(xiàn)的。

表1 轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,%)Tab.1 The effect of Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation±s,%)

表1 轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,%)Tab.1 The effect of Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation±s,%)

Note:Compared with LLC group,1)P＜0.05;Compared with pcDNA3.1-LLC group,2)P＜0.05.

Groups Inhibitory rate of T cell proliferation LLC 21.58±0.08 pcDNA3.1-LLC 16.78±0.06 pcDNA3.1-Foxp3-LLC 47.08±0.051)2)

表2 轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞上清對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,%)Tab.2 The effect of the supernatant from cultured Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation(±s,%)

表2 轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞上清對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,%)Tab.2 The effect of the supernatant from cultured Foxp3 transfected LLC cells on T cell proliferation(±s,%)

Note:Compared with LLC group,1)P＜0.05;Compared with pcDNA3.1-LLC group,2)P＜0.05.

Groups Inhibitory rate of T cell proliferation LLC 14.68±0.07 pcDNA3.1-LLC 11.78±0.03 pcDNA3.1-Foxp3-LLC 37.58±0.061)2)

2.7 轉(zhuǎn)染 Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì)TGF-β1和IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 為研究LLC細(xì)胞中Foxp3對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制作用的可能機(jī)制,采用RTPCR和ELISA方法檢測(cè)Foxp3過表達(dá)對(duì)免疫抑制因子TGF-β1和IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組細(xì)胞中 TGF-β1和 IL-10 mRNA表達(dá)較LLC組、pcDNA3.1-LLC組明顯增強(qiáng)(P ＜0.05),見圖 8、圖 9;同時(shí) ,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組培養(yǎng)上清中TGF-β1和IL-10蛋白的含量較LLC組、pcDNA3.1-LLC組也均有顯著增加(P＜0.05),而在LLC組和pcDNA3.1-LLC組之間無明顯差異(P＞0.05),見圖10。結(jié)果提示,LLC細(xì)胞中Foxp3可能通過上調(diào)免疫抑制因子TGF-β1和IL-10的表達(dá)從而抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。

圖8 轉(zhuǎn)染 Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì) TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Theeffect of Foxp3 transfected LLCcells on mRNA expression of TGF-β1 and IL-10

圖9 轉(zhuǎn)染 Foxp3的LLC細(xì)胞對(duì) TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)影響Fig.9 Theeffect of Foxp3 transfected LLCcells on mRNA expression of TGF-β1and IL-10

圖10 轉(zhuǎn)染 Foxp3的LLC細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)TGF-β1和IL-10蛋白分泌的影響Fig.10 The effect of Foxp3 transfected LLC culture supernatant on protein secretion of TGF-β1 and IL-10

3 討論

目前Foxp3仍然被認(rèn)為是Tregs的一個(gè)最特異標(biāo)志,在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮重要作用[14]。最新研究發(fā)現(xiàn),Foxp3在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或胞漿內(nèi)也有表達(dá)[8-13]。Hinz等[8]發(fā)現(xiàn)TGF-β2可誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤細(xì)胞中Foxp3的表達(dá),通過小干擾RNA方法特異地抑制腫瘤細(xì)胞Foxp3表達(dá)后,IL-6、IL-8的表達(dá)上調(diào)。Merlo等[9]對(duì)397例乳腺癌標(biāo)本的研究顯示Foxp3的表達(dá)與患者總生存率密切相關(guān),可作為臨床預(yù)測(cè)預(yù)后的獨(dú)立因子。而Zuo等[10]對(duì)乳腺癌的研究顯示Foxp3可以抑制癌基因SKP2轉(zhuǎn)錄,并抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR和免疫組化方法分別檢測(cè)了小鼠LLC肺癌細(xì)胞株Foxp3的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示Foxp3在mRNA和蛋白水平均有表達(dá),而且免疫組化結(jié)果顯示Foxp3蛋白主要分布于細(xì)胞核,表明Foxp3在小鼠LLC細(xì)胞主要為核表達(dá)。

Tregs在腫瘤免疫中發(fā)揮免疫抑制作用,而Foxp3在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探討LLC細(xì)胞中Foxp3的作用是否和在Tregs中一樣通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖而參與腫瘤的免疫逃逸過程。首先構(gòu)建pcDNA3.1-Foxp3真核表達(dá)載體,將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞,通過RT-PCR和免疫組化方法從基因和蛋白水平證實(shí)了Foxp3的過表達(dá)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示,LLC組、pcDNA3.1-LLC組及pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細(xì)胞及其上清均可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化,并且pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細(xì)胞及其上清對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著。結(jié)果表明在有無細(xì)胞直接接觸的情況下,Foxp3均可顯著抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。因此推測(cè)Foxp3在LLC細(xì)胞的作用可能與其在Tregs中的作用一樣通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖參與腫瘤的免疫逃逸。

TGF-β1和IL-10是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制分子。TGF-β1作為TGF-β超家族的成員,是一種強(qiáng)大的免疫抑制因子,可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[15]。IL-10對(duì)多種免疫細(xì)胞有抑制作用,從而介導(dǎo)免疫抑制。有研究報(bào)道Foxp3在Tregs發(fā)揮免疫抑制的主要機(jī)制之一是通過細(xì)胞間直接接觸或分泌TGF-β1和IL-10的方式直接或間接參與了腫瘤免疫逃逸的過程[16,17]。為此,我們檢測(cè)了Foxp3過表達(dá)的LLC細(xì)胞中 TGF-β1和 IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,pcDNA3.1-Foxp3-LLC組的細(xì)胞中TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)水平較 LLC組、pcDNA3.1-LLC組均明顯增強(qiáng),而且其培養(yǎng)上清中TGF-β1和IL-10蛋白的濃度較LLC組、pcDNA3.1-LLC組均顯著增加。表明LLC細(xì)胞中的Foxp3與免疫抑制因子TGF-β1和IL-10密切相關(guān),LLC細(xì)胞中Foxp3抑制T淋巴細(xì)胞的增殖作用可能是通過上調(diào)TGF-β1和 IL-10 的表達(dá),促進(jìn)TGF-β1 和 IL-10 的分泌而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞上清對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用弱于轉(zhuǎn)染Foxp3的LLC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞直接接觸時(shí)的抑制作用,提示除了免疫抑制因子TGF-β1和IL-10的作用外,可能還有其他機(jī)制參與其中,有待進(jìn)一步研究。

以上研究表明,小鼠LLC細(xì)胞Foxp3可能通過上調(diào)TGF-β1和IL-10的表達(dá)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖從而參與腫瘤的免疫逃逸。因此,在腫瘤微環(huán)境中,不僅Tregs發(fā)揮免疫抑制作用促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸,同時(shí),腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Foxp3也參與了腫瘤的免疫逃逸作用。深入研究腫瘤細(xì)胞Foxp3在腫瘤免疫逃逸過程中的作用機(jī)理將會(huì)為腫瘤的免疫治療提供新的靶位和治療途徑。

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