輻照含銀同種異體神經(jīng)移植后動物微量細胞毒試驗觀察

吳燕文，辛國華，曾元臨，張道坤

周圍神經(jīng)缺損在創(chuàng)傷、電損傷中較常見，目前治療周圍神經(jīng)缺損的最有效方法仍是自體神經(jīng)移植，由于自體材料來源有限，加之取的皮神經(jīng)較細小，且易造成供區(qū)功能喪失。很多研究人員嘗試用異體神經(jīng)移植，并進行了大量實驗研究。同種異體神經(jīng)移植需要解決消除免疫性、組織保存、神經(jīng)再生效果和機能恢復、術后感染等問題。處理異體神經(jīng)的方法有很多，如低溫冷凍、凍干、凍融、血漿浸泡、輻照等方法都被實驗證實能較好的降低異體神經(jīng)的抗原性及保存，移植實驗也證實了較好的移植效果。但以上方法只有輻照能較好的降低異體神經(jīng)的抗原性同時能滅菌，阻止肝炎、艾滋病等的病原體的傳播[1]，無疑在應用于人體移植方面更具優(yōu)勢。但經(jīng)以上方法處理的異體神經(jīng)都不具有抗菌性能，不能有效防止移植后的感染。Ag+是一種極強的無機金屬離子殺菌劑，筆者嘗試用復方銀溶液浸泡后再輻照處理同種異體神經(jīng)，并觀察移植術后宿主的免疫排斥反應，以期為臨床治療提供一種新的良好異體神經(jīng)材料。

1 材料與方法

1.1 異體神經(jīng)的制備 取6只新鮮南昌大白兔（南昌大學實驗動物中心提供）坐骨神經(jīng)。①輻照含銀同種異體神經(jīng)組：坐骨神經(jīng)用生理鹽水沖洗干凈后，在配制好的復方銀（主要含0.5%氟哌酸和0.3%硝酸銀）溶液中浸泡12 h后取出，待溶液滴干，用濕無菌紗布包裹裝入已消毒鋁薄塑料袋中封口，送X線照射（斯科達直線加速器），照射溫度為0～5℃，放射輻照時間為 12 h，總劑量 20kGy，貯存于-30～-40℃冰箱中備用；②深低溫冷凍處理組：坐骨神經(jīng)用生理鹽水沖洗干凈后，浸在保護液（DMEM+10%甘油）中15 min，取出放入已消毒的玻璃瓶中密閉封存，置于-80℃深低溫冰箱中保存，10 d后可以使用。使用前，放入37℃恒溫水浴中復溫2 min，然后置于生理鹽水（含100 U/ml慶大霉素）中浸泡15 min。

1.2 實驗分組 將18只大白兔（南昌大學實驗動物中心提供），不分性別，體重2.0～2.5 kg，隨機分為A、B、C三組，每組6只，A組移植輻照含銀同種異體神經(jīng)，B組移植深低溫冷凍異體神經(jīng)，C組自體神經(jīng)互植。

1.3 手術方法 3%異戊巴比妥鈉腹腔（30 mg/kg）注射麻醉，大腿后部正中切口，顯露梨狀肌下緣至脛腓分叉處的坐骨神經(jīng)段，移植2 cm長輻照含銀同種異體神經(jīng)1根，以7-0線無損傷縫線行神經(jīng)束膜吻合；同樣方法暴露對側坐骨神經(jīng)，移植2 cm長輻照含銀同種異體神經(jīng)1根。B組暴露左右坐骨神經(jīng)，分別截取2 cm移植同長度深低溫冷凍異體神經(jīng)，C組暴露左右坐骨神經(jīng)，截取2 cm長的坐骨神經(jīng)后自體互植。

1.4 微量淋巴細胞毒反應試驗 ①淋巴細胞懸液制備：取健康南昌大白兔腸系膜淋巴結3個，經(jīng)NS和DMEM液沖洗血跡，用100目不銹鋼篩研磨制成單個細胞懸液，提取2 ml，加入1/2量的淋巴細胞分離液2 000×g離心15 min，用吸管將分離液面的淋巴細胞移入試管內(nèi)，再加入等量的DMEM液進行稀釋1 500×g離心15 min，用毛細胞吸管吸取少量細胞液沖入記數(shù)板內(nèi)，顯微鏡下計數(shù)，制備成5×106/ml淋巴細胞懸液，置4℃冰箱備用；②淋巴細胞毒測定：分別于術后4、8周取動脈血2 ml，注入標記好的試管內(nèi)，待凝固后，1 000×g離心15 min，將上層血清移入試管內(nèi)，在微量多孔反應板每空內(nèi)加入50 μl抗血清、50 μl淋巴細胞懸液，輕輕振動，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化（37℃，45 min），冷卻后加補體（由豚鼠血清制備）100 μl，室溫下培養(yǎng) 1 h。 取 30 μl上述液體加臺盼藍10 μl染色5 min，顯微鏡下計數(shù)。每個處理組均含4個平行孔。

2 結 果

微量淋巴細胞毒反應試驗結果輻照含銀組淋巴細胞死亡率與自體組比較無顯著性差異（P＞0.05），但均低于冷凍組（P＜0.01）。 見表 1。

表1 兩組淋巴細胞死亡率（±s，%）

表1 兩組淋巴細胞死亡率（±s，%）

與 A、C 組比較，*P＜0.01

組別 術后4周 術后8周A 13.13±3.00 12.14±2.10 B 40.13±3.21* 31.21±3.23*C 11.34±3.11 10.02±2.79

3 討 論

Fawett等[2]認為，神經(jīng)移植體需具有以下特征：①再生軸突必須能順利長入,并通過該移植體達到遠端；②通過移植體的軸突必須成熟到具有正常的直徑,正常的髓鞘化和正常的傳導動作電位；③無抗原性；④能較快地獲得血供；⑤移植體內(nèi)再生軸突必須排列有序,以確保準確地到達靶組織、靶器官。輻照方法是通過60Coγ射線照射使雪旺（Schwann）細胞受損并降解而被吞噬細胞所吞噬或排除而降低抗原性，其殘?；け槐Ａ粼谠?，這種基膜可在神經(jīng)移植中作為一種“導管”而助于周圍神經(jīng)的再生[3]。用輻照處理異體神經(jīng)移植后，纖維組織增生和炎性細胞浸潤較少，再生的神經(jīng)纖維數(shù)量增多，比自體神經(jīng)移植修復效果差，但優(yōu)于未經(jīng)處理的異體神經(jīng)移植[4]。

Ag+是一種極強的無機金屬離子殺菌劑，水中銀離子濃度為0.01 mg/L時即有殺菌作用；其殺菌原理是帶陽電荷的Ag+能夠吸附住在帶有陰電荷的細菌表面，甚至向細胞內(nèi)滲透，與細菌蛋白結合使細菌蛋白沉淀，還可使細菌賴之起呼吸作用的酶催化變性，以及與細菌巰基酶等生物活性基團結合，使細菌機體結構破壞，導致其迅速死亡等；Ag+已作為一種有效殺菌劑廣泛應用于創(chuàng)面覆蓋物，應用于殺菌，及制作無機抗菌材料等；Ag+與銅、鋅、氟等離子合用具有協(xié)同作用，殺菌作用強，并可保持較長時間殺菌；Ag+是機體內(nèi)組織成分之一，過量對人體只可產(chǎn)生銀斑，無不良反應[5]。本實驗將兔同種異體神經(jīng)經(jīng)復方硝酸銀浸泡后再經(jīng)輻照，實驗發(fā)現(xiàn)其富含抗菌物質(zhì)（Ag+），抑菌試驗證實其對標準菌株和臨床菌株均具有很強的抗菌作用。

輻照含銀同種異體神經(jīng)移植后淋巴細胞毒試驗顯示淋巴細胞死亡率與自體移植組無明顯差別，與新鮮異體組差別明顯，說明對輻照含銀同種異體神經(jīng)移植無明顯排斥反應。筆者借鑒李國輝等[6]的方法將異體神經(jīng)經(jīng)復方硝酸銀溶液浸泡、60Coγ射線照射處理制成輻照含銀同種異體神經(jīng)，方法簡單，既降低了抗原性，又具有較強的抗菌作用，符合神經(jīng)移植材料的要求，是周圍神經(jīng)缺損移植的比較理想材料。

[1]Moore TM,Gendler E.Viruses absorbed on musculoskeletal allografts are inactivated by terminal ethylene oxide disinfection.J Orthop Res,2004,22(6):1358.

[2]Fawcett JW,Keynes RJ.Muscle basal lamina:a new graft material for peripheral nerve repair.J Neurosurg,1986,65(3):354.

[3]Wang XY,Fan QY.Reginergation of nerve-ending and motor end-plate of exsomatized nerve graft following irradiation.J Forth Mil Med Uinv,2000,21(4):514.

[4]李建兵,姚建民,宋建良,等.放射輻照對異體神經(jīng)移植影響的實驗研究.浙江臨床醫(yī)學,2000,2(4):222.

[5]薛廣波.實用消毒學.北京:人民軍醫(yī)出版社,1986.704.

[6]李國輝,曹 勇,吳焱卿,等.輻照氟銀豬皮的實驗研究.中華整形燒傷外科雜志,1994,10(3):206.