同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備

郭杰標(biāo)，許 楊，劉師文

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

氟喹諾酮是一類強(qiáng)效、廣譜的合成抗菌素，通過抑制細(xì)菌DNA解旋酶發(fā)揮抗菌效力[1]。這類藥物在畜牧、水產(chǎn)業(yè)被廣泛應(yīng)用治療和預(yù)防細(xì)菌感染，并作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[2]。恩諾沙星是獸藥領(lǐng)域最常用的氟喹諾酮藥物，我國(guó)制定了在食品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRLs)，以避免這兩種藥物在食品中的殘留所造成的細(xì)菌耐藥性和過敏反應(yīng)等健康危害。

目前，檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的主要微生物法[1]和儀器學(xué)方法，包括液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜[3-6]，毛細(xì)管電泳[7]等。微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng)，而儀器學(xué)方法需要昂貴的設(shè)備且運(yùn)行費(fèi)用高，難以在基層檢測(cè)部門廣泛推廣。檢測(cè)一種氟喹諾酮藥物[8-10]和檢測(cè)氟喹諾酮藥物總量[11-13]的免疫學(xué)方法已有報(bào)道，但是同時(shí)檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的免疫學(xué)法還有待開發(fā)。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式見圖1，本研究采用環(huán)丙沙星作為代表半抗原制備人工抗原，并將其免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供條件。

圖1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of enrofloxacin and ciprofloxacin

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

恩諾沙星和環(huán)丙沙星 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；弗氏完全(不完全)佐劑、戊二醛、葡萄糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗 Gene Tex公司；96孔酶標(biāo)板 Costar公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Ultrospec紫外-可見光掃描儀 美國(guó)安瑪西亞公司；Multiskan MCC/340酶標(biāo)儀 Labsystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠(雌性，4周齡)購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批準(zhǔn)號(hào)為：贛(動(dòng))96-021)。

1.3 方法

1.3.1 糖基化牛血清白蛋白的制備[14]

葡萄糖、乳糖和載體蛋白按照20:20:1的物質(zhì)的量比混合，調(diào)節(jié)至pH9.5，在40～42℃振蕩2h，使還原糖上的醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生偶聯(lián)，完成對(duì)載體蛋白的牛血清白蛋白糖基化修飾。

1.3.2 環(huán)丙沙星免疫抗原的制備

把糖基化BSA的質(zhì)量濃度固定為2mg/mL，戊二醛投料質(zhì)量濃度固定為60.6μg/mL，環(huán)丙沙星投料質(zhì)量濃度分別為0.85、1.06、1.27mg/mL。調(diào)節(jié)pH9.5在25℃振蕩12h，合成3種不同偶聯(lián)比的環(huán)丙沙星免疫抗原。用0.05mol/L PBS(pH7.4)透析3d，備用。

1.3.3 環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原的制備

OVA的質(zhì)量濃度為2mg/mL，戊二醛的投料質(zhì)量濃度為44.4μg/mL，環(huán)丙沙星的投料質(zhì)量濃度0.62mg/mL。調(diào)節(jié)pH9.5在25℃振蕩12h，合成環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原。用0.05mol/L PBS (pH7.4)透析3d，備用。

1.3.4 環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比例的計(jì)算

環(huán)丙沙星區(qū)別于載體蛋白的特征吸收波長(zhǎng)為340nm，在該波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)K=4.5mL/mg，人工抗原蛋白濃度的測(cè)定使用雙縮脲法[15]。

1.3.5 小鼠免疫

取4周齡的雌性Balb/c小鼠，以100μg/只的抗原劑量，加完全佐劑充分乳化后，皮下多點(diǎn)初次免疫。28d后，以不完全佐劑乳化抗原以加強(qiáng)免疫。之后每21d，以同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。對(duì)照組采用非糖基化載體制備的免疫抗原進(jìn)行免疫。

1.3.6 抗體效價(jià)檢測(cè)

參照Guo等[16]的方法，分別采用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定免疫后小鼠血清的抗體效價(jià)和抗體對(duì)環(huán)丙沙星的特異性。

1.3.7 單克隆抗體篩選與鑒定

參照Guo等[16]的方法，篩選得到分泌抗環(huán)丙沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)所獲得抗體的特性進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的合成

環(huán)丙沙星人工抗原的制備原理見圖2。戊二醛是雙功能試劑，通過和蛋白質(zhì)上的氨基和環(huán)丙沙星哌嗪環(huán)上的亞氨基反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)丙沙星和載體蛋白之間連接，使恩諾沙星和環(huán)丙沙星的共同結(jié)構(gòu)暴露在人工抗原的外部，成為主要的抗原位點(diǎn)。

圖2 人工抗原的合成Fig.2 Synthesis route of artificial antigen

環(huán)丙沙星人工抗原的連接效果，用紫外掃描圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖3)。按照1.3.2節(jié)制備的3種環(huán)丙沙星免疫抗原，經(jīng)檢測(cè)偶聯(lián)比分別為6.3:1、7.2:1和8.3:1。按照1.3.3節(jié)制備的環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原，經(jīng)檢測(cè)偶聯(lián)比為2.4:1。

圖3 載體蛋白、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星免疫抗原溶液的紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of glycosylated BSA, ciprofloxacin and ciprofloxacin immunogen

戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。圖4是分別以糖基化載體和天然載體制備的環(huán)丙沙星抗原免疫的SDS PAGE圖譜。泳道3顯示，使用天然BSA制備的免疫抗原，在戊二醛作用下造成了載體蛋白蛋白的聚集。

圖4 天然BSA和糖基化BSA制備的環(huán)丙沙星免疫抗原SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

葡萄糖、乳糖是還原糖，分子結(jié)構(gòu)中含有醛基，在偏堿性條件葡萄糖和乳糖會(huì)與BSA上的氨基縮合，把蛋白上的氨基封閉。泳道4顯示，經(jīng)過糖基化BSA分子質(zhì)量比天然BSA(泳道2)增大。泳道5顯示，以糖基化BSA為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原，由戊二醛導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象得到了避免。

由此可見，使用糖基化載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原，由于載體蛋白上的氨基數(shù)量減少，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量。

2.2 免疫小鼠效果

圖5 糖基化載體和天然載體制備的抗原免疫小鼠的效果比較Fig.5 Comparison of antiserum titer induced by ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

本研究使用糖基化BSA為載體，如1.3.2節(jié)合成的3種偶聯(lián)比的糖基化環(huán)丙沙星免疫抗原。前期合成的以天然BSA為載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原中，免疫動(dòng)物效果最好的是偶聯(lián)比為9.1:1的抗原。本實(shí)驗(yàn)以天然BSA為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原作對(duì)照，評(píng)價(jià)3種糖基化環(huán)丙沙星抗原免疫小鼠的效果。4種抗原免疫小鼠后抗體效價(jià)的上升曲線見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用糖基化BSA為載體制備的3種免疫抗原，比對(duì)照抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗環(huán)丙沙星特異性抗體的能力要強(qiáng)很多。

2.3 單克隆抗體的篩選與鑒定

本實(shí)驗(yàn)使用免疫效果最好的糖基化免疫抗原，在第4次免疫之后獲得了較高的抗體效價(jià)。通過細(xì)胞融合，順利獲得了檢測(cè)環(huán)丙沙星及其代謝前體恩諾沙星的單克隆抗體(1G3)。經(jīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行鑒定，該抗體對(duì)這兩種藥品的IC50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL，靈敏度和特異性能夠滿足同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品在食品中的殘留的需要。

3 討 論

環(huán)丙沙星是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)后才可以免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。經(jīng)過分析和比較，發(fā)現(xiàn)把環(huán)丙沙星分子中哌嗪環(huán)上的亞氨基作為連接位點(diǎn)制備的人工抗原，有利于獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結(jié)構(gòu)的抗體。

有文獻(xiàn)報(bào)道，制備人工抗原的連接臂的最適長(zhǎng)度在3～6個(gè)碳原子，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長(zhǎng)又會(huì)造成折疊導(dǎo)致半抗原分子被載體蛋白掩蓋不利于產(chǎn)生抗體[17]，戊二醛作為連接手臂正好符合3～6個(gè)碳原子的條件。戊二醛在堿性條件下可以與氨基或亞氨基縮合，能夠把環(huán)丙沙星上的亞氨基連接到蛋白載體上。

戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。使用糖基化載體制備免疫抗原，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量和免疫原性。通過免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合，篩選出了一株對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供了條件。

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