初診2型糖尿病患者外周血內(nèi)皮祖細胞的研究*

陳樹春 宋光耀 孫 陽 馬慧娟

大血管并發(fā)癥是糖尿病的重要并發(fā)癥，血管內(nèi)皮功能失調(diào)在其發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類可特異性歸巢于損傷區(qū)域，并能分化增殖為成熟內(nèi)皮細胞的一群干/祖細胞，其定居于骨髓,可以動員到外周血,遷移、歸巢到血管新生或損傷部位,并在靶區(qū)域增殖、分化為內(nèi)皮細胞，從而修復受損的血管內(nèi)皮。有學者認為可應用CD34+KDR+的EPCs計數(shù)來獨立地預測心血管事件的發(fā)生[1]。本研究旨在探討2型糖尿?。═2DM）患者內(nèi)皮依賴性血管舒張功能及循環(huán)EPCs數(shù)量的變化,并進一步了解兩者間關(guān)系以及炎癥對其影響，以期為預防和治療T2DM血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年3月—6月我院門診或住院初診為T2DM患者35例,均符合1999年WHO T2DM診斷標準，均不伴有糖尿病視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及血管病變。正常對照組20例，均為我院同期健康查體者，無糖尿病家族史，排除空腹血糖受損、糖耐量受損及糖尿病。所有入選者均排除高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。?、腦血管病，無肝、腎功能障礙，所有受試者研究期間未應用任何藥物。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮功能的測定 根據(jù)Celermajer等[2]的方法采用二維超聲成像掃描法分別測定受試者休息、反應性充血試驗及含服硝酸甘油后的肱動脈內(nèi)徑，分別為D0、D1、D2。內(nèi)皮依賴性血管舒張功能（EDV）＝（D1－D0）/D0×100%，非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能（EIV）＝（D2－D0）/D0×100%。以肱動脈內(nèi)徑擴張≥10%為血管內(nèi)皮功能正常，＜10%為異常。所用儀器為美國通用公司PHILIPS HDI 5000型彩色超聲診斷儀，探頭頻率7.0 MHz，探查深度4 cm。

1.2.2 各項生化指標的測定 所有受試者取血前24 h禁酒，停用所有藥物，經(jīng)過夜禁食12 h以上，第2天清晨取坐位，經(jīng)肘正中靜脈取血。采血4 mL離心測三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PBG）、胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（HbA1c）及超敏C反應蛋白（hsCRP）。然后檢測體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù)（BMI）及血壓。血脂用生化比色法，血糖測定用葡萄糖氧化酶法，胰島素用放免法，hsCRP的測定采用散射比濁法，用李光偉等[3]的公式計算胰島素敏感指數(shù)（IAI）來評估胰島素抵抗（IR）。

1.2.3 外周血EPCs水平的測定 受試者清晨空腹采肘正中靜脈血2 mL，肝素抗凝。加入FITC標記的CD34單克隆抗體（BD公司生產(chǎn)），加入PE標記的KDR（VEGFR－2）單克隆抗體（BD公司生產(chǎn)）對細胞進行標記，經(jīng)孵育、洗滌后上機分析。采用BD公司的FACS Calibur流式細胞儀以CellQuest軟件進行流式細胞分析。在前向角和側(cè)向角散射光雙參數(shù)點圖上對淋巴細胞群設(shè)窗，共收集細胞10 000個，CD34和KDR雙陽性（CD34＋/KDR＋）細胞數(shù)即為EPCs水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，對所測定結(jié)果進行正態(tài)檢驗，空腹胰島素（FINS）和呈偏態(tài)分布，取其自然對數(shù)轉(zhuǎn)為正態(tài)分布后進行分析。組間均數(shù)比較用t檢驗或t′檢驗；率的比較采用χ2檢驗，多因素分析用多元線性回歸。相關(guān)分析應用Pearson直線相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床指標比較2組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；T2DM組BMI、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、TG、TC、FBG、HbA1c、hsCRP及FINS高于對照組（P<0.05），IAI顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。T2DM組的EDV水平及EPCs數(shù)量較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），2組間EIV及基礎(chǔ)內(nèi)徑比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.2 EDV水平與EPCs的關(guān)系T2DM組EDV與EPCs的數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.430，P<0.05）。

表1 2組受試者臨床和生化指標比較 （±s）

表1 2組受試者臨床和生化指標比較 （±s）

*P＜0．05，**P＜0．01，表2同；1 mm Hg=0.133 kPa

對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35性別（男/女）11/9 19/16 0.003年齡（歲）45.96±6.69 47.94±7.36 0.99 BMI（kg/m2）23.21±2.32 26.06±3.30 3.405 2**SBP（mm Hg）121.30±8.31 132.49±6.38 5.597 2**組別n DBP（mm Hg）74.37±5.40 81.34±8.15 3.804 8*FINS（mU/L）2.13±0.53 2.81±0.58 4.312 1**-3.79±0.57-4.65±0.64 4.982 1**TG(mmol/L)0.99±0.56 1.89±0.10 7.122 8*對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35組別nIAI TC(mmol/L)4.41±1.04 5.21±1.10 2.670 8*FBG(mmol/L)5.19±0.67 8.73±2.35 8.338 5*2 h PBG(mmol/L)6.94±2.36 13.00±4.67 6.382 0*HbA1c(%)5.34±0.23 8.36±1.31 13.285 0*hsCRP(mg/L)7.42±0.13 10.68±0.31 54.403 5*對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35組別n

表2 2組肱動脈內(nèi)皮舒張功能及EPCs數(shù)量的比較（±s）

表2 2組肱動脈內(nèi)皮舒張功能及EPCs數(shù)量的比較（±s）

組別對照組T2DM t或t′基礎(chǔ)內(nèi)徑（%）3.49±0.51 3.56±0.50 0.495 9 EDV（%）10.45±3.21 2.62±0.26 10.888 3*EIV（%）13.76±2.31 15.58±6.81 1.442 5 EPCs 14.20±1.92 10.14±1.03 15.587 8**

2.3 多元回歸分析 以EPCs數(shù)量作為因變量，將BMI、SBP、DBP、IAI、TC、TG、hsCRP、HbA1c作為自變量，進行逐步多元線性回歸分析顯示，hsCRP、IAI和HbA1c進入方程，方程式為贊=-0.096+0.216 X1-0.247 X2-2.113 X3（：EPCs數(shù)量；X1：lnIAI；X2：HbA1c；X3：hsCRP），復相關(guān)系數(shù)分別為0.324、0.279及0.310，均P<0.05。

3 討論

糖尿病患者是動脈硬化和心血管疾病發(fā)生的高危人群。血管內(nèi)皮是動脈硬化的“第一道防線”，血管內(nèi)皮功能失調(diào)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是心血管疾病的危險因素。內(nèi)皮功能障礙可影響內(nèi)皮功能的損傷及修復的動態(tài)平衡，EPCs是內(nèi)皮修復的關(guān)鍵因素之一，在維持以上平衡中發(fā)揮著重要作用。

筆者前期研究顯示，糖尿病的血管內(nèi)皮功能失調(diào)出現(xiàn)在糖尿病診斷之前，且與IR、脂代謝異常及炎癥因子相關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示，排除藥物、吸煙等影響，未治療的初診T2DM患者存在血糖升高、肥胖、脂代謝紊亂、IR以及血管內(nèi)皮功能障礙，說明在初診的糖尿病患者已經(jīng)存在發(fā)生大血管并發(fā)癥的危險。

內(nèi)皮功能障礙是由內(nèi)皮功能的損害和修復之間的動態(tài)平衡失調(diào)導致，EPCs可以直接分化成內(nèi)皮細胞，也可以通過旁分泌血管生成因子，動員骨髓祖細胞和激活成熟內(nèi)皮細胞[5]，使損傷的內(nèi)皮得以修復，所以EPCs數(shù)量和功能下降會影響血管內(nèi)皮損傷的修復，進而加重內(nèi)皮功能損傷。本研究結(jié)果顯示，初診的T2DM患者存在EPCs數(shù)量下降，且EDV與EPCs的數(shù)量呈正相關(guān)，與Krankel等[6]的研究一致，進一步說明了EFCs對維持正常血管內(nèi)皮功能的重要性。

本研究以EPCs數(shù)量作為因變量進行逐步多元回歸分析表明，hsCRP、lnIAI和HbA1c進入方程，說明炎癥、IR和長期高血糖是EPCs功能和數(shù)量的影響因素。有研究表明，健康者的EPCs在高糖條件下培養(yǎng),其數(shù)量、產(chǎn)生一氧化氮（NO）的能力、遷移能力和成血管能力均下降[7]；高糖狀態(tài)下造成的氧化應激可使EPCs的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）通路受阻，從而影響EPCs的分化、成血管能力和凋亡；高糖介導的FoxO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化/乙?；Ш饪赡苁笷oxO蛋白表達增加,上調(diào)前凋亡基因表達,介導EPCs凋亡，從而影響EPCs的功能和數(shù)量[8]。糖代謝紊亂的程度和時間長短與EPCs的數(shù)量及功能密切相關(guān)，即糖尿病時間越長、血糖越高，EPCs功能損害越重。糖尿病患者的EPCs功能變化在控制血糖后可以部分修復。胰島素有可能通過胰島素受體底物（IRS）和PI3K/Akt途徑發(fā)揮雙相作用，在生理濃度下磷酸化Akt可以導致內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化,增加NO釋放，促進EPCs的功能，而在胰島素抵抗時,高濃度胰島素使IRS/PI32K/Akt通路受阻，損害EPCs的功能[9]。炎癥對EPCs的數(shù)量和功能存在一定影響，CRP作為一個典型的炎癥因子，可通過減少EPCs NOS表達而抑制EPCs的分化、存活和功能[10]，還可以使EPCs的活性氧（ROS）產(chǎn)生增加，降低細胞的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）活性，縮短端粒的長度，同時降低EPCs抗氧化酶的表達，上調(diào)了EPCs糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）的表達，促使EPCs的氧化應激而發(fā)生衰老和功能紊亂，進一步導致細胞凋亡增加[11-12]。

綜上所述，未治療的初診T2DM患者存在與血糖控制、IR及炎癥相關(guān)的血管內(nèi)皮功能受損和EPCs數(shù)量及功能的下降，提示良好的血糖控制、改善胰島素敏感性和炎癥控制有益于干預糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

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