人類表皮生長因子受體 2的 B細胞表位初步預測分析

周珠哈,王 安,吳 樂,朱珊麗,朱冠保,張麗芳

人類表皮生長因子受體2(HER2/neu)是一種原癌基因,定位于染色體 17q21,編碼一個 185 kDa的跨膜受體酪氨酸激酶,也稱為 p185[1],是表皮生長因子受體 (EGFR)家族的第二成員,HER2/neu自身可形成同源二聚體或與 EGFR其他成員形成異源二聚體,繼而發(fā)生磷酸化,激活其胞內(nèi)酪氨酸激酶,將細胞生長信號和其他相關信號持續(xù)地傳導給細胞,最終導致細胞的增殖、癌變、對化療藥物耐受等一系列生物學性狀的改變[2]。HER2/neu基因的擴增或過度表達見于許多上皮源性腫瘤中,如原發(fā)性浸潤性乳腺癌 (25% ～30%)、胃癌(10%～20%),其表達程度與腫瘤的臨床分期及預后密切相關[3-4],是不良預后的獨立預測因子[5-6]。曲佐單抗 (herceptin)是人源化的 HER2/neu靶向單克隆抗體,在 HER2/neu過表達的乳腺癌及胃癌患者的臨床治療中取得了顯著療效[7-8]。使 HER2/neu成為理想的抗腫瘤免疫治療的靶標。B細胞表位是抗原中可被 B細胞抗原受體或抗體特異性識別并結(jié)合的線性片段或空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對 B細胞表位進行準確預測,不僅有助于腫瘤基礎免疫學研究,而且對腫瘤疫苗和抗體的研究與開發(fā)、診斷與治療均具有重要意義。本研究利用生物信息軟件系統(tǒng)及相關抗原性指數(shù)等,預測分析了 HER2/neu的二級結(jié)構(gòu)及其 B細胞優(yōu)勢表位,為 HER2/neu單克隆抗體的制備和基因工程疫苗的設計和研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HER2/neu氨基酸序列:HER2/neu完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列檢索自 Swiss Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法 HER2/neu二級結(jié)構(gòu)預測:采用 EXPASY服務器提供的 SOPMA、GOR、HNN方法預測。HER2/neu跨膜區(qū)域預測:采用 EXPASY服務器提供的 SOSUI方法。HER2/neu親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)預測:采用EXPASY服務器提供的 Hopp＆ Woods、Zimmerman方法和DNAstar軟件的 Protean進行 Emini和 Jameson-Wolf分析。對上述方法預測的結(jié)果進行綜合分析,兼顧各預測參數(shù)推斷HER2/neu的 B細胞表位,并用吳玉章等[9]建立的抗原性指數(shù)綜合評判 HER2/neu的 B細胞優(yōu)勢表位。

2 結(jié)果

2.1 HER2/neu的氨基酸序列 取自 Swiss Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(編號:P04626),共 1 255個氨基酸,相對分子質(zhì)量 137 910 Da。

2.2 HER2/neu的二級結(jié)構(gòu)預測 分別應用 EXPASY服務器上的 GOR、HNN、SOPMA方法預測 HER2/neu的二級結(jié)構(gòu)。選取標準:3種方案中,取至少有兩個方案預測結(jié)果一致的重疊區(qū)為準。無規(guī)則卷曲主要位于 N端的 16～22,26～40,55～70,117～137,157～165,186～215,220～251,258～270,274～288,298～302,305～310,315～321,324～339,377～394,414～421,446～451,497～504,509～539,556～572,579～584,590～595,599～613,617～652,696～707,727～731,741～747,756～764,813～819,854～858,900～904,918～927,938～947,962～967,991～1 001,1 010～1 015,1 026～1 042,1 046～1 059,1 062～1 084,1 087～1 180,1 187～1 219,1 223～1 255區(qū)段,它們可維持HER2/neu分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。HER2/neu二級結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域以無規(guī)則卷曲為主,少見 β-轉(zhuǎn)角。用 Kruskal-Wallis H Test檢驗 3種方法預測對 HER2/neu二級結(jié)構(gòu)中的 α-螺旋、β-片層、無規(guī)則卷曲和 β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)成比的差別,結(jié)果表明 3種方法對 HER2/neu二級結(jié)構(gòu)的預測分析結(jié)果間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.995,見表 1)。

2.3 HER2/neu跨膜區(qū)域預測 經(jīng) SOSUI方法分析,HER2/neu為具有 2次跨膜螺旋的膜蛋白,分別為 1～23,652～674區(qū)段,膜外區(qū)域位于 N端 24～651區(qū)段,膜內(nèi)區(qū)域位于 N端675～1 255(見表 2,圖 1)。

表 1 GOR4、HNN、SOPMA 3種方法預測 HER2/neu二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比 〔n(%)〕Table 1 Constitution ratio of HER2/neu secondary structure predicted by GOR4,HNN and SOPMA

表 2 SOSUI方法預測 HER2/neu跨膜區(qū)域Table 2 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

圖 1 SOSUI方法預測 HER2/neu跨膜區(qū)域Figur e 1 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

2.4 HER2/neu蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)預測 綜合各參數(shù)分析 HER2的 B細胞表位所在的優(yōu)勢區(qū)段:30～38,117～124,186～195,224～237,245～251,281～288,324～339,380～388,456～465,497～504,601～606,617～623,633～652,939～943,992～997,1 049～1 057,1 106～1 116,1 121～1 126,1 140～1158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246(見圖 2、表 3)。

圖 2 各種不同參數(shù)對 HER2/neu的預測結(jié)果Figure 2 Prediction of HER2/neu with various parameters

表 3 不同方法預測 HER2/neu二級結(jié)構(gòu)區(qū)域結(jié)果Table 3 Epitopes predicted by various methods

2.5 HER2/neu抗原表位的綜合分析 綜合以上預測結(jié)果,根據(jù)吳玉章等[10]的抗原性指數(shù)計算方法,計算 HER2/neu可能的 B細胞表位區(qū)段平均抗原性指數(shù),結(jié)果顯示 HER2/neu N端:497～504,939～943,1 106～1 116,1 140～1 158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246區(qū)段的抗原性指數(shù)相對較高 (見表 4),可能為 HER2/neu腫瘤抗原的優(yōu)勢 B細胞表位。

表 4 HER2/neu的 B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域的平均抗原性指數(shù)Table 4 Average antigenicity index of epitopes

3 討論

在免疫應答過程中,B細胞表位供 B細胞受體 (BCR)識別誘導抗體應答,合理設計表位疫苗可以增強特異的保護性免疫反應的強度,避免常規(guī)抗原結(jié)構(gòu)中可能出現(xiàn)的非必要的、抑制性表位的作用,以減少疫苗的不良反應。利用生物信息學的技術(shù)方法,對目的蛋白質(zhì)的優(yōu)勢抗原表位進行預測分析,可預先對表位疫苗進行設計以減少研究的盲目性。

B細胞表位在結(jié)構(gòu)上可分為連續(xù)性的線性表位和不連續(xù)的空間構(gòu)象表位。構(gòu)象表位是蛋白質(zhì)的二級或三級結(jié)構(gòu),不太穩(wěn)定,在蛋白質(zhì)受熱或酶解變性后會徹底破壞,不能恢復,分離和研究比較困難,因此目前大多數(shù) B細胞表位預測方法是預測由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性 B細胞表位。

預測 B細胞表位主要的參數(shù)有二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原性以及柔韌性等。雖然親水性和可及性是形成表位的首要條件,但決定表位是否具有抗原性尚需多種因素的參與,因而表位的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)序列中肽鏈的局部可及性或柔韌性與相應部位的抗原性也密切相關。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)對抗原表位有很大影響。α-螺旋、β-折疊的化學鍵鍵能比較高,能夠較牢固地維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),但很難合適地與抗體嵌合,且經(jīng)常處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部,因而很少能成為抗原表位所在區(qū)域。而 β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等柔性結(jié)構(gòu)比較松散,易于發(fā)生扭曲、盤旋,并展示在蛋白質(zhì)的表面,成為抗原表位的可能性較大。

吳玉章等[10]綜合考慮蛋白質(zhì)的多種性質(zhì),如片段的活動性、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和氨基酸側(cè)鏈的排列等,建立了抗原性指數(shù)預測方法,用以篩選 B細胞優(yōu)勢表位。發(fā)現(xiàn) B細胞表位中 Leu、Thr、Pro、Asp、Asn、Glu、His、Lys、 Arg比一般蛋白質(zhì)中常見 ;Gly、Ala、Val、Ile、Cys、 Met、Gln、Phe、 Tyr、Trp正相反,Ser則與一般蛋白質(zhì)中的發(fā)現(xiàn)頻率相等。這種氨基酸組成上的差異可能與蛋白質(zhì)的抗原性有關,親水性殘基更易出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面,因此,某些氨基酸殘基在表位中出現(xiàn)的頻率更高,其抗原性指數(shù)就更大。

本研究通過對二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及性與抗原性等多種參數(shù)的綜合比較分析,預測了 HER2/neu可能的B細胞優(yōu)勢表位,為該蛋白表位疫苗設計及單克隆抗體的制備等研究提供了理論依據(jù)。

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