茶樹ISSR-PCR 反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

寧?kù)o，黃建安，李娟，鐘興剛，朱旗

(1.湖南省茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙410125；2.茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

茶樹的遺傳基礎(chǔ)研究目前還比較薄弱．傳統(tǒng)育種方法依賴表現(xiàn)型選擇，局限性較大．簡(jiǎn)單重復(fù)間序列 (ISSR)能反映出比RFLP、SSR 和RAPD 更豐富的多態(tài)性，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來在品種資源鑒定[1-4]、遺傳多樣性研究[5-6]、遺傳圖譜構(gòu)建[7-8]中得到了廣泛的應(yīng)用．利用正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化茶樹ISSR-PCR 反應(yīng)體系的研究尚未見報(bào)道．由于該方法是基于PCR 的一種標(biāo)記，其反應(yīng)條件易受到各因素濃度的影響．為了確保ISSR 分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，通常需要對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件．筆者對(duì)茶樹ISSR-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行正交優(yōu)化，旨在為利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)茶樹種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 供試材料與主要儀器

2009年4月，于湖南省茶葉研究所種質(zhì)資源圃采用茶樹1芽2葉新梢，提取其DNA作為ISSR-PCR擴(kuò)增的模板．

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．Taq 酶(5 U/μL)、dNTP(10 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、Buffer 均為MBI 公司產(chǎn)品．標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)B031-1 購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司．ISSR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成．經(jīng)篩選，把引物UBC827 (AC)8G 作為正交試驗(yàn)的引物．

主要儀器與設(shè)備為臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(MIKR022R)、PTC-100TMPCR擴(kuò)增儀、梯度PCR 擴(kuò)增儀(Biometra)、凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(Gene Genius)、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)、DYY-Ⅲ水平電泳槽(北京六一儀器廠)、超低溫冰箱、微波爐、電子天平、移液器、快速混勻器、高壓蒸汽滅菌鍋、超純水器、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)及其他分子生物學(xué)常用設(shè)備．

1.2 方 法

1.2.1 DNA 的提取

參照黃建安[9]等的方法，采用改良的CTAB 法提取茶樹基因組DNA，在島津紫外分光光度計(jì)上測(cè)定所提DNA 的濃度和純度，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的相對(duì)分子質(zhì)量及降解程度，并將其稀釋至40 ng/μL，備用．

1.2.2 PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交設(shè)計(jì)[10]L16(45)，對(duì)參與ISSR-PCR 反應(yīng)的5 個(gè)因素在4 個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn)(表1)．共16個(gè)處理，每處理2 個(gè)重復(fù)，按表1 中的數(shù)據(jù)加樣．在PTC-100TMPCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL，除表中所列因素外，每管還有10×PCR Buffer．

1. 2. 3 PCR 擴(kuò)增程序和退火溫度選擇

反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共38 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．反應(yīng)結(jié)束后，ISSR-PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)于3 V/cm 下電泳約80 min．電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用DPS 軟件分析，得到茶樹ISSR-PCR 反應(yīng)各因素的最佳水平．選用引物ISSR1、UBC881，根據(jù)其Tm 值分別設(shè)置最低溫度46、48 ℃，最高溫度66.0、64.0 ℃，在梯度PCR擴(kuò)增儀上自動(dòng)生成12 個(gè)溫度，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，篩選出最適退火溫度．

表1 ISSR-PCR 反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L16(45) orthogonal design for the factors and levels of PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳結(jié)果評(píng)分

圖1 正交試驗(yàn)ISSR-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of ISSR-PCR products

參照何正文等[11]的正交設(shè)計(jì)直觀分析方法，根據(jù)圖1 電泳結(jié)果和本試驗(yàn)?zāi)康模瑢?6 個(gè)處理從高 到低依次評(píng)分，最佳產(chǎn)物(條帶豐富，清晰度高，背景低)記為16 分，最差產(chǎn)物記為1 分．圖1 中各處理從左至右重復(fù)記分結(jié)果依次為2、2；4、5；11、11；1、1；9、10；10、9；8、7；15、16；5、4；12、13；13、12；7、8；6、6；3、3；14、14；16、15．

2.2 各因素對(duì)ISSR-PCR 反應(yīng)影響的差異

由表2 中F 值可知，dNTP 濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響較大，模板DNA 濃度的影響最?。蒔 值可知，各因素水平間的差異均達(dá)到極顯著水平．

表2 ISSR-PCR 反應(yīng)各因素間方差分析表Table 2 The variance analysis for the factors of ISSR-PCR reaction

2.3 各因素對(duì)ISSR-PCR 結(jié)果的影響

2.3.1 Taq 酶濃度的影響

當(dāng)Taq 酶濃度為0.5～1.0 U/(20 μL)時(shí)，均值隨Taq 酶濃度的增加急劇上升，在1.0 U/(20 μL)時(shí)達(dá)到峰值；Taq 酶濃度繼續(xù)增加，均值下降，但下降趨勢(shì)不明顯，且1.5～2.0 U/(20 μL)時(shí)的結(jié)果差異不大．可見，Taq 酶濃度過低，PCR產(chǎn)物信號(hào)較弱，產(chǎn)物合成效率低；濃度過高，造成非特異性擴(kuò)增，電泳背景加深，因此，選取1.0 U/(20 μL)作為茶樹ISSR-PCR反應(yīng)體系中Taq酶的最佳濃度．

2.3.2 Mg2+濃度的影響

當(dāng)Mg2+濃度為1.0～2.0 mmol/L 時(shí)，反應(yīng)結(jié)果差異明顯；均值隨濃度的增加急劇上升，2.0 mol/L時(shí)達(dá)到最高，2.5 mol/L 時(shí)有所下降，表明Mg2+濃度過低，Taq 酶作用效率低，PCR 產(chǎn)物多態(tài)性不高；濃度過高，容易產(chǎn)生非特異性彌散帶，故選取2.0 mol/L 為茶樹ISSR 反應(yīng)體系中Mg2+的最佳濃度．

2.3.3 模板DNA 濃度的影響

當(dāng)模板DNA濃度為40～60 ng/(20 μL)時(shí)，反應(yīng)結(jié)果差異明顯；均值隨濃度的增加急劇下降，在60～100 ng/(20 μL)呈緩慢上升趨勢(shì)，但均值變化不大，表明在60～100 ng/(20 μL)，模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果影響不大，所以，選取40 ng/(20 μL)為茶樹ISSR-PCR 反應(yīng)體系中模板DNA的最適濃度．

2.3.4 dNTP 濃度的影響

當(dāng)dNTP 濃度為0.1～0.2 mmol/L 時(shí)，均值隨濃度增加而上升，在0.2 mmol/L 時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)dNTP濃度為0.2～0.25 mmol/L 時(shí)，差異明顯，隨濃度的增加而下降，表明dNTP 作為PCR 反應(yīng)的原料，濃度太低會(huì)使擴(kuò)增反應(yīng)不完全，從而降低PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量；濃度過高會(huì)對(duì)Mg2+產(chǎn)生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Taq 酶的活力，造成浪費(fèi)，因此，選取0.20 mmol/L 為茶樹ISSR 反應(yīng)體系中dNTP 的最適濃度．

2.3.5 引物濃度的影響

當(dāng)引物濃度為0.25～0.30 μmol/L 時(shí)，均值隨濃度的增加明顯下降；當(dāng)引物濃度為 0.30～0.35 μmol/L 時(shí)均值無明顯差異；當(dāng)引物濃度為0.35～0.4 μmol/L 時(shí)，均值呈下降趨勢(shì)，表明濃度過高容易使電泳背景加深，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，故選取0.25 μmol/L 為茶樹ISSR 反應(yīng)體系中引物的最佳濃度．

2.4 最適退火溫度的確定

圖2 引物ISSR1 梯度退火電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of annealing temperature on ISSR amplification of primer ISSR1

圖3 引物UBC881 梯度退火電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of annealing temperature on ISSR amplification of primer UBC881

由圖2 和圖3 可知，退火溫度過低時(shí)，擴(kuò)增特 異性差，條帶彌散，背景深；退火溫度過高時(shí)，引物與模板結(jié)合差，PCR 產(chǎn)物多態(tài)性低，電泳條帶亮度變?nèi)?，不同引物的最適退火溫度也不同，所以，確立引物ISSR1、UBC881 的最適退火溫度分別為52.4，59.0 ℃．

3 結(jié)論與討論

20 μL茶樹ISSR-PCR反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶為1.0 U/(20 μL)，Mg2+為2.0 mmol/L，模板為40 ng/(20 μL)，dNTP 為0.20 mmol/L，引物為0.25 μmol/L．引物ISSR1、UBC881的最適退火溫度分別為52.4、59.0 ℃，表明最適退火溫度因引物而異．

目前，建立茶樹ISSR-PCR反應(yīng)體系使用較多的方法是單因素試驗(yàn)法[12-13]．該方法過程繁瑣，既不能考察各因素間的交互作用，也不能保證各因素最佳濃度的組合就是反應(yīng)的最佳體系．正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有均衡分散、綜合可比及可伸縮、效應(yīng)明確等特性，既能考察各因素的交互作用，又可分析每一因素不同水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生的影響，克服了單因素試驗(yàn)顧此失彼、試驗(yàn)規(guī)模大的缺點(diǎn)，從而快速地找到最優(yōu)的水平組合[14-16]．本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)茶樹進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)．

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