花 血清免疫酶活力對水溫耐受性的研究

方美娟，劉 凱，李智強(qiáng)

（1.浙江海洋學(xué)院蕭山科技學(xué)院,浙江杭州 311258；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江杭州 310024）

魚類是水生變溫脊椎動(dòng)物，其生理代謝和生化反應(yīng)在一定程度上受環(huán)境因素影響較大，水溫是影響其生理代謝及其生化反應(yīng)的重要影響因子。當(dāng)水溫發(fā)生變化時(shí)，血液組織中各種酶催化反映的條件就發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活力發(fā)生改變。

花 Hemibarbus maculatus Bleeker屬鯉形目、鯉科、鮈亞科、 屬，俗稱季郎魚、溪竹等，是我國江河中重要的中小型經(jīng)濟(jì)魚類。該魚具有食性雜、分布廣、群體產(chǎn)量高，體形優(yōu)雅、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、市場俏銷等特點(diǎn)。目前，對于探討水溫變化對花 生存及血清酶指標(biāo)影響的研究，仍未見有報(bào)道。因此本文主要探討了花 的生存溫度和適宜溫度及水溫變化對其血清免疫酶活力的影響，以期為花 的苗種繁育與養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用花 體重為100～200 g/尾，暫養(yǎng)在水族箱中，投喂顆粒飼料，每日清污、換水，pH為8.0～9.0。待穩(wěn)定后隨機(jī)抽取健康無損傷、活性較強(qiáng)的個(gè)體分組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中遮光控制光強(qiáng)。

1.2 溫度耐受性實(shí)驗(yàn)

在水族箱中暫養(yǎng)，用控溫電熱棒和冰袋控溫，設(shè)3個(gè)平行組，每組放入試驗(yàn)魚10尾，將花 從自然水溫 20 ℃開始每 6 h 升高或下降 4 ℃，直到設(shè)置水溫止，實(shí)驗(yàn)水溫梯度設(shè)置為 4、8、12、16、20、24、28、32、36℃。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持水體不斷充氣，養(yǎng)殖過程中不投餌。以花 身體不動(dòng)但輕輕敲打后能游動(dòng)稱休克；長時(shí)間敲打身體不動(dòng)則認(rèn)為花 死亡。

1.3 水溫脅迫對血清免疫酶活力影響的實(shí)驗(yàn)

1.3.1 血清的制備

從水中撈起花 ，迅速用濾紙吸干其體表水分后，直接從魚的心臟采血，在室溫下放置2～4 h，待血凝固收縮后，再放入4℃的冰箱中，靜置過夜，使血塊進(jìn)一步收縮和析出血清。之后在5 000 r/min，4℃下離心5 min，收集上清液即為血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶活力測定

應(yīng)用試劑盒測定方法進(jìn)行測定，測定酶類為抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT），水解酶（酸性磷酸酶ACP和堿性磷酸酶AKP），所有試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS 13.0 for Windows軟件進(jìn)行方差分析、多重比較及回歸分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 花 的溫度耐受性

水溫耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1），花 的生存水溫較廣，為4～32℃，適宜水溫為8～24℃。

表1 花 對溫度變化的耐受性Tab.1 The temperature tolerance of Hemibarbus maculatus Bleeker

2.2 水溫脅迫對血清酶活力的影響

2.2.1 水溫脅迫對抗氧化酶（SOD和CAT）活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），在溫度脅迫下，血清SOD活性隨著溫度的不斷升高而發(fā)生顯著變化。24℃以前，SOD活性隨水溫顯著升高，在24℃時(shí)達(dá)到最高，且顯著高于4℃、8℃、12℃各實(shí)驗(yàn)組，（P＜0.05）；24℃以后，雖然SOD活性無顯著地緩慢增加，但有逐漸下降趨勢；采用二次回歸曲線擬合，其變化趨勢如圖2所示，呈現(xiàn)為拋物線規(guī)律，其擬合二元方程為SOD=36.802+12.345T-0.208T（2T表示溫度，P＜0.001）。

圖1 水溫脅迫對血清抗氧化酶活力的影響Fig.1 The effect of temperature on the activity of antioxidant enzymes

花 血清CAT活性隨水溫升高呈現(xiàn)出上升的趨勢，但CAT活性在個(gè)體之間存在較大的變異，最大個(gè)體CAT活性出現(xiàn)在36℃，最小個(gè)體CAT活性出現(xiàn)在4℃，但方差分析表明，水溫對血清CAT活性無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 血清SOD活性與水溫的二元擬合回歸曲線Fig.2 Regression curve of serum SOD activity and temperature

2.2.2 水溫脅迫對水解酶ACP、AKP活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），在溫度脅迫下，血清AKP活性隨著溫度的不斷升高呈現(xiàn)出先升后降的變化，其中以4℃條件下花 血清AKP活性最低，與8℃組魚血清AKP活性無顯著性差異（P＞0.05），但與其他各組差異顯著（P＞0.05）；而以24℃條件下花 血清AKP活性最高，與4℃、8℃、12℃、32 ℃各組魚血清 AKP 活性差異顯著性，（P＞0.05），但與其他各組無顯著性差異，（P＞0.05）；采用二次回歸曲線擬合，其變化趨勢如圖4，呈現(xiàn)為拋物線規(guī)律，其擬合二元方程為AKP=28.817+3.999 T-0.083 T（2P＜0.001）。

圖3 水溫脅迫對血清水解酶活力的影響Fig.3 The effect of temperature on the activity of the serum hydrolytic enzymes

花 血清ACP活性隨水溫升高呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，隨著水溫的升高，ACP活性顯著上升，其中以4℃條件下花 血清ACP活性最低，與8℃組魚血清ACP活性無顯著性差異（P＞0.05），但與其他各組差異顯著（P＞0.05）；而以36℃條件下花 血清ACP活性最高，與20℃、24℃、28℃、32℃各組魚血清 AKP活性無顯著性差異（P＞0.05），但與其他各組差異顯著（P＞0.05）；根據(jù)回歸統(tǒng)計(jì)ACP活性與水溫間有顯著的直線回歸關(guān)系，其回歸曲線圖如圖5所示，回歸方程為 ACP=6.190+0.229 T（P＜0.001）。

圖5 血清ACP活性與水溫的一元擬合回歸曲線Fig.5 Regression curve of serum ACP activity and temperature

圖4 血清AKP活性與水溫的二元擬合回歸曲線Fig.4 Regression curve of serum AKP activity and temperature

3 討論

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，華鯪Sinilabeo rendahli幼魚的生存溫度為5～38℃，適宜溫度為13～29 ℃[1]，嘉庚蛸 Octopus tankaheei的生存溫度為 0.5～35 ℃，適宜溫度為 12～31 ℃[2]，莫桑比克鰻鱺Anguillamor morata的生存溫度為0～40℃，適宜溫度為12～35℃[3]，齊口裂腹魚幼魚Schizothorax(schizothorax)prenanti的生存溫度為 0.8～33.5 ℃，適宜溫度為 5～27℃[4]，花 溫度的生存溫度為4～32℃，適宜溫度為8～24℃，與其它水生動(dòng)物相比，花 的生存溫度和適宜溫度也是比較廣的，對溫度的耐受性稍微低于莫桑比克鰻鱺[5]等。

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中最主要的兩種抗氧化酶，在抗氧化過程中具有協(xié)同作用，當(dāng)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的超氧陰離子（O2-）和H2O2等自由基后，O2-由SOD清除，CAT則起協(xié)同清除H2O2的作用[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1、2），水溫脅迫對抗氧化酶活力的影響是顯著的，在不同溫度脅迫下，花 血清SOD活力的變化在24℃以前SOD活性增強(qiáng)尤為顯著（P＜0.05）。SOD被認(rèn)為是機(jī)體對抗自然水溫暴露的保護(hù)劑[11]，隨著水溫升高，SOD活性不斷增強(qiáng)，說明SOD在高溫條件下對機(jī)體內(nèi)由于溫度升高而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，消除過多的自由基從而維持機(jī)體代謝平衡。CAT活力在各溫度組間未表現(xiàn)出顯著差異，溫度的變化對CAT活性影響不明顯，推測可能由于溫度升高所造成的氧化應(yīng)激多數(shù)以O(shè)2-等自由基離子為主，而H2O2相對較少。

AKP和ACP是體內(nèi)最重要的兩種水解酶，廣泛存在于動(dòng)物血液和各種器官內(nèi)，是評價(jià)動(dòng)物生理代謝水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7，8]?；?是常年生活在水中的變溫脊椎動(dòng)物，水溫的變化可顯著影響其生理代謝水平?；?的適宜溫度為8～24℃，當(dāng)水溫超過36℃時(shí)會造成一些個(gè)體的熱死亡，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的幾組高溫實(shí)驗(yàn)組必然對花 造成了一種熱應(yīng)激，從而使其代謝水平下降，表現(xiàn)為水解酶AKP和ACP活性的降低。本實(shí)驗(yàn)表明，水溫脅迫對花 水解酶活力的影響是顯著的，高溫和低溫都會使水解酶活力顯著降低，這可能是由于在水溫脅迫下，細(xì)胞生理代謝效率降低，從而導(dǎo)致在細(xì)胞中的ACP和AKP酶活力下降。

溫度是池塘養(yǎng)殖花 最重要的環(huán)境因子之一，它直接影響花 的代謝和免疫等生化指標(biāo)，突然的環(huán)境變化包括臺風(fēng)和池塘通風(fēng)條件等，都會導(dǎo)致水溫的迅速變化。因此在花 養(yǎng)殖過程中應(yīng)特別注意這些因素的影響，盡量保持養(yǎng)殖水溫在適宜范圍內(nèi)。

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