歐文氏桿菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表達(dá)

李 炫，彭克勤，劉正初

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

甘露聚糖酶是一種重要的工程酶，能降解甘露聚糖、木質(zhì)素等物質(zhì)，在紡織、造紙、飼料、食品、石油開(kāi)采等諸多領(lǐng)域都有重要用途[1]。該酶在對(duì)草本植物纖維提取中半纖維素的降解方面起著舉足輕重的作用[2]。中國(guó)農(nóng)科院麻類研究所工程酶實(shí)驗(yàn)室篩選到的歐文氏菌CXJZ95-198具有較高的甘露聚糖酶活性，張運(yùn)雄等克隆到其甘露聚糖基因manA，分析發(fā)現(xiàn)manA基因的DNA序列與其他DNA序列同源性很低[3-4]。本研究構(gòu)建了N端缺失片段的表達(dá)載體，初步研究了manA N端部分序列的功能，旨在為以后改造甘露聚糖酶基因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 歐文氏桿菌CXJZ95-198，大腸桿菌E.coliBL21（DE3），載體pET 28 a由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所工程酶實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑BamHI、HindIII、T4連接 酶 、PCR Supermix、DNA mark III 等 均 購(gòu) 自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及目的基因的PCR擴(kuò)增 如表1所示，根據(jù)GenBank報(bào)道的甘露聚糖酶基因序列（DQ364440）設(shè)計(jì)了以下5個(gè)引物，均由上海生工合成。用PCR方法對(duì)CXJZ95-198全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃，變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸 10 min，冷卻至4℃。

1.2.2 manA及缺失片段突變體的獲得 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、膠回收后，分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3 h，回收目的片段，連入pET 28 a載體。連接過(guò)夜體系如下：1 μL pET 28 a載體，5 μL 目的 DNA，1 μL T4 DNA 連接酶，3 μL dd H2O。連接產(chǎn)物通過(guò)42℃熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞里，37℃ 恢復(fù)培養(yǎng)1 h后涂于含50 μg/mL卡那霉素的選擇性LB平板上，倒置37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.3 表達(dá)載體的鑒定 用BamHI和HindIII對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)3 h，電泳檢測(cè)酶切。

1.2.4 表達(dá)載體在大腸桿菌里的表達(dá)與甘露聚糖酶活性的鑒定 挑取陽(yáng)性克隆子接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)5 h，點(diǎn)種于甘露聚糖酶篩選平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察透明圈產(chǎn)生情況。

1.2.5 重組子表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析 對(duì)重組子表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒在酶切以前是閉環(huán)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，無(wú)法被凝膠電泳反映其真實(shí)大小，但被限制性內(nèi)切酶切成線性形狀后，它的長(zhǎng)度可以在電泳圖中反映出來(lái)，圖1是pET 28 a在BamHI和HindIII雙酶切后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，條帶大小約是5 000 bp左右，與pET 28 a質(zhì)粒的實(shí)際大小5 361 bp相符。

以CXJZ95-198基因組為模板，如表2所示，按目的片段 pF1（F1/R1）、pF2（F2/R1）、pF3（F3/R1）、pF4（F4/R1）加入相應(yīng)的正反引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2），結(jié)果表明目的片段擴(kuò)增特異性很好，濃度合適。

表2 擴(kuò)增缺失片段的對(duì)應(yīng)引物以及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.2 缺失表達(dá)載體的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

分別提取能在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板中生長(zhǎng)的pF1-pF4轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，5 μL質(zhì)粒加入BamHI和HindIII 37℃保溫2 h后用凝膠電泳驗(yàn)證。如圖3所示，1～4泳道中4 500 bp以上的條帶是大小為5 000 bp左右的pET 28 a質(zhì)粒，1 200～800 bp之間呈梯度排列的條帶是pF1-pF4 DNA片段，說(shuō)明所挑取的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

2.3 重組子的甘露聚糖酶活性活性鑒定

挑取pF1-pF4轉(zhuǎn)化子的典型菌落點(diǎn)在甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察各轉(zhuǎn)化子在甘露聚糖篩選培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的透明圈可初步判斷該轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶情況。如圖4所示，陽(yáng)性對(duì)照歐文氏桿菌CXJZ95-198產(chǎn)酶能力很高，生成的水解圈比其他各缺失表達(dá)體系都大，說(shuō)明該酶在大腸桿菌高效表達(dá)體系中優(yōu)勢(shì)不明顯。陰性對(duì)照大腸桿菌E.coliBL21（DE）不分泌甘露聚糖酶，不產(chǎn)生透明圈。4個(gè)缺失表達(dá)體系橫向?qū)Ρ?，pF1透明圈最大，pF2和pF3酶活性較pF1大幅下降，pF4沒(méi)有甘露聚糖酶活性，pF1和pF2橫向?qū)Ρ日f(shuō)明缺失了的信號(hào)肽序列對(duì)酶活或者酶的分泌能力有負(fù)面影響，pF2和pF3透明圈大小無(wú)明顯差異說(shuō)明N端信號(hào)肽后10個(gè)AA對(duì)該酶的活性無(wú)影響，可刪除。pF4和pF3比較說(shuō)明pF4多刪除的10個(gè)AA對(duì)該酶的活性有非常重要的影響。

2.4 重組子表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

分別挑取pF1-pF4四種菌的陽(yáng)性克隆子的單菌落，在5 mL含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)6 h，再將活化菌按2%的比例接種100 mL含有同樣濃度的卡那霉素LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600=0.6時(shí)加入0.8 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，20 h后分別收集菌體跑SDS-PAGE電泳。

如圖5所示，在45 kD左右能很清晰地看到很明顯的蛋白條帶，比其他條帶濃很多，大小與預(yù)測(cè)的大小相符，可以認(rèn)為是目的蛋白帶，pF1-pF4的蛋白帶由大到小成成的梯度反應(yīng)了依次缺失的序列所翻譯的蛋白質(zhì)大小依次縮小。與目的期望相符，pF1強(qiáng)表達(dá)兩條帶，大小相差不多，除了預(yù)測(cè)在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強(qiáng)表達(dá)一條帶，從氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)得知manA N端前27個(gè)AA為信號(hào)肽序列，pF1包含了信號(hào)肽序列，pF2-pF4都缺失了信號(hào)肽序列，所以pF1的胞內(nèi)蛋白存在分泌途徑已切除信號(hào)肽和未切除信號(hào)肽，有兩條帶，其他重組子胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物只有一條帶。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了4種不同的表達(dá)載體，分別是pF1（manA全長(zhǎng)），pF2（N端27個(gè)AA缺失），pF3（N端37個(gè)AA缺失），pF4（N端47個(gè)AA缺失）。用甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pF4不表現(xiàn)出甘露聚糖酶活性，pF3，pF2都表現(xiàn)出較弱酶活性，pF1酶活性最高，但也低于原始菌CXJZ95-198，表明ManA N端37-47個(gè)AA可能對(duì)該酶結(jié)構(gòu)或活性有重要影響。N端27-37個(gè)AA缺失對(duì)該酶無(wú)明顯影響，N端信號(hào)肽缺失對(duì)該酶的分泌有較大負(fù)面影響。在對(duì)蛋白SDS-PAGE膠進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)pF1表達(dá)兩條帶，大小相差不多，除了預(yù)測(cè)在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強(qiáng)表達(dá)一條帶，胞外分泌蛋白重量最大的pF1卻比pF2，pF3，pF4的蛋白條帶小，甚至小于45 kD。推測(cè)因?yàn)閜F1包含了信號(hào)肽序列，pF2－pF 4都缺失了信號(hào)肽序列，所以pF1的胞內(nèi)蛋白存在分泌途徑已切除信號(hào)肽和未切除信號(hào)肽，有兩條帶。胞外分泌蛋白只表示切除信號(hào)肽分泌到胞外的，所以只有一條帶。

[1]吳 襟.微生物 β-甘露聚糖酶 [J].微生物通報(bào)，1999，26（2）:134-136.

[2]劉正初.麻類纖維提取工程微生物研究回顧與展望[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（增刊）：1363-367.

[3]yunxiong Z，zhengchu L，Xinbo C.Cloning and expression of a mannanase gene from Erwinia carotovora CXJZ95-198[J].Annals of microbiology，2007，57（4）：623-628.

[4]張運(yùn)雄.麻類生物脫膠與生物制漿酶系[J].中國(guó)麻作，2003，24（2）：14-17.

[5]張龍翔，張廷方，李令媛.生化試驗(yàn)方法與技術(shù) [M].北京:高等教育出版社，1997.