清熱祛濕方對2型糖尿病胰島素抵抗模型大鼠TNF-α影響的實(shí)驗(yàn)研究1)

丁 艷,劉金玲張 潔,曹 瑩,王好杰,王立琴

祖國醫(yī)學(xué)對消渴、胰島素抵抗(IR)的論述多從陰虛燥熱立論。近年來,濕熱內(nèi)阻成為2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。深入研究濕熱證對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及IR的影響,對于臨床改善IR和防治由此引起的各種血管并發(fā)癥具有十分重要的意義[1]。根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論及臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制了清熱祛濕方。為了進(jìn)一步探討其療效及作用機(jī)制,進(jìn)行了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性W istar大鼠90只,10周齡,體重(170±20)g,購自山東省試驗(yàn)動(dòng)物中心,質(zhì)量合格證號SCXK(魯)20050004。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心?；A(chǔ)飼料熱卡配比:碳水化合物占60%,蛋白質(zhì)占22%,脂肪占10%,維生素及礦物質(zhì)等成分占8%,高脂飼料:碳水化合物占30%,蛋白質(zhì)占12%,脂肪占52%(動(dòng)物脂肪為主),維生素及礦物質(zhì)等成分占6%。

1.2 藥品 清熱祛濕方藥由濰坊市中醫(yī)院制劑室煎制。方劑組成:川黃連12 g,炒蒼術(shù)15 g,厚樸10 g,炒枳殼15 g,茵陳30 g,佩蘭12 g,當(dāng)歸15 g,薏苡仁20 g,玄參12 g,丹參15 g。以上方藥加500m L清水浸泡30 m in,文火煎煮至150 m L,煎煮2次,混合煎取液,水浴濃縮成劑量為2.5 g/m L的藥液,4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。對照組予二甲雙胍(格華止,中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn),每片500 mg,生產(chǎn)批號:國藥準(zhǔn)字H 20023370)。二甲雙胍溶入生理鹽水中配成混懸液,4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。以?種藥液均按《人和動(dòng)物間按體表面積折算的最小劑量比值表》換算。

1.3 試劑和儀器 STZ(美國Califonia chemistry公司),TNF-α(上海晶美生物技術(shù)公司的ELISA試劑盒),大鼠專用胰島素放免試劑(北京北方生物技術(shù)研究所)。Accuchek advantageⅡ型血糖儀由羅氏公司提供,高速低溫離心機(jī)(RC5C型,美國Beckman公司),γ-計(jì)數(shù)器(FJ-2003150型,瑞典Pharmacia),752型分光光度計(jì)(上海分析儀器廠),Elecsys 2010型化學(xué)發(fā)光儀,7170型自動(dòng)分析儀,冰箱,恒溫振蕩器等。

1.4 方法

1.4.1 造模及給藥方法 采用喂養(yǎng)高脂飼料加腹腔注射STZ的方法復(fù)制IR模型[2]。90只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,其中,正常組10只普食飼養(yǎng),其余每組16只,飼以高脂飼料。1月后,高脂飼料飼養(yǎng)的大鼠給予STZ 30 mg/kg腹腔注射,1周后以空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為2型糖尿病IR大鼠造模成功。正常組腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)2m L～3 m L,1周后空腹血糖處于正常范圍內(nèi)為正常組大鼠。取50只模型大鼠隨機(jī)分為清熱祛濕方低、中、高劑量組,二甲雙胍組,模型組,每組10只,與正常組一起納入研究。清熱祛濕方低、中、高劑量組分別以清熱祛濕方溶液按4 m l/(kg?d)、8 ml/(kg?d)、16m l/(kg?d)加蒸餾水至4m L灌胃,二甲雙胍組以二甲雙胍100mg/(kg?d)溶于4m L水中灌胃。正常組和模型組均以4m L蒸餾水灌胃。每2周剪尾取血監(jiān)測血糖1次,以禁食6h的非空腹血糖下降至正常組平均水平或與造模成功時(shí)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為治療有效。于給藥2月后禁食12h,腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,放入-80℃冰箱待檢。整個(gè)試驗(yàn)過程中,數(shù)據(jù)保留完整的大鼠分別為正常組10只,清熱祛濕方低劑量組7只,中劑量組8只,高劑量組7只,二甲雙胍組7只,模型組7只。

1.4.2 監(jiān)測項(xiàng)目及方法 分別測定體重、FBG、空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、TNF-α,計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(IAI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

2 結(jié) 果

2.1 模型大鼠一般情況 2型糖尿病IR大鼠造模成功后,模型大鼠體重增加,活動(dòng)減少,進(jìn)食量、飲水量增加,對外界反應(yīng)能力下降。各組大鼠治療前后體重比較結(jié)果顯示:與治療前比較,清熱祛濕方中、高劑量治療組及二甲雙胍組均可明顯降低大鼠體重(P＜0.05),治療后各組比較,中、高劑量組與二甲雙胍組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示清熱祛濕方治療及二甲雙胍治療干預(yù)均可減輕模型大鼠體重,且中、高劑量組減輕體重的作用與二甲雙胍組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組大鼠治療前后體重比較(±s)g

表1 各組大鼠治療前后體重比較(±s)g

組別n治療前治療后正常組10218.10±4.68207.50±5.91模型組7248.96±7.93249.14±5.73低劑量組7249.29±8.01228.86±6.30中劑量組8251.75±5.01213.25±5.901)高劑量組7248.43±7.22208.86±5.961)二甲雙胍組7250.11±4.54216.57±7.001)

2.2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較 模型大鼠血清TNF-α水平明顯升高,血脂顯著升高,且以TG升高為主。治療后清熱祛濕方治療組及二甲雙胍組血TNF-α、TC、TG下降(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較,血清TNF-α、TC、TG下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療后與二甲雙胍組比較,中、高劑量組血清TNF-α、TG水平降低(P＜0.05)。清熱祛濕方可降低血清TNF-α、TC、TG水平,而且隨著劑量的增大,療效增加。與二甲雙胍治療比較療效更加顯著。詳見表2。

表2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較(±s)mmol/L

表2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較(±s)mmol/L

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2.3 各組大鼠FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比較 造模成功后,大鼠FBG及FINS明顯升高,胰島素敏感性降低,加重了胰島素抵抗。治療后中、高劑量組及二甲雙胍組FBG、FINS、IAI、HOMA-IR均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),并以中、高劑量組下降最明顯;與模型組比較,中、高劑量組及二甲雙胍組FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與二甲雙胍組比較,FBG變化無差異,但中、高劑量組FINS、IAI、HOMA-IR變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。清熱祛濕方可明顯降低糖尿病大鼠血糖及胰島素水平,增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,且隨著劑量的增加,療效更加顯著。詳見表3。

表3 各組大鼠治療前后FBG、FINS、IAIHOMA-IR比較(±s)

表3 各組大鼠治療前后FBG、FINS、IAIHOMA-IR比較(±s)

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3 討 論

2型糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。在中醫(yī)經(jīng)典論著中沒有與IR相對應(yīng)的專門論述,但其臨床表現(xiàn)多屬于中醫(yī)“肥滿”“眩暈”“消渴”等范疇[3]。如《素問?通評虛實(shí)論》指出“消癉,肥貴人,則膏粱之疾也”。祖國醫(yī)學(xué)對糖尿病、IR多從陰虛燥熱、痰濁血瘀立論。近年來,隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,2型糖尿病IR患者多見濕熱中阻者[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為消渴病的主要病因?yàn)殚L期食用肥甘厚膩之品,復(fù)因運(yùn)動(dòng)減少,而致脾失健運(yùn),運(yùn)化水濕功能下降,食滯中焦郁而化熱,導(dǎo)致濕熱中阻,津液敷布失常,可見口干多飲,多尿等癥,久而發(fā)為消渴。脾失健運(yùn),濕熱內(nèi)蘊(yùn)是其主要病機(jī)。脾虛為本,濕熱為標(biāo),故清熱祛濕,健脾行氣是其治療大法,脾氣得健則濕熱自除,在IR的治療中尤為重要。遵“法從證立,方從法出”的組方原則,組成清熱祛濕方。方中川黃連、蒼術(shù)、厚樸清熱健脾燥濕行氣為君藥;佩蘭、枳殼化濕行氣,茵陳清熱祛濕,加川黃連清熱祛濕作用為臣藥;當(dāng)歸、薏苡仁、玄參、丹參活血健脾利濕為佐使藥。諸藥合用共奏清熱祛濕,健脾行氣之功。

TNF-α與IR密切相關(guān)[5],而關(guān)于中藥改善TNF-α所致IR的報(bào)道較少。實(shí)驗(yàn)研究證明,清熱祛濕、健脾行氣治療可明顯降低血TNF-α水平,同時(shí)可減輕體重,有效改善糖、脂代謝異常,從而增加胰島素敏感性,改善IR,且隨著劑量的增加療效更加顯著。清熱祛濕治療可明顯改善濕熱內(nèi)阻型糖尿病患者的IR,其治療作用是多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的。該療法為中醫(yī)藥防治2型糖尿病IR提供了新的思路和靶點(diǎn)。但上述研究僅限于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,推廣用于臨床治療尚有待于進(jìn)一步的研究。

[1] 熊曼琪,朱章志.中醫(yī)中藥治療非胰島素依賴性糖尿病必須研究IR[J].中醫(yī)雜志,1995,36(1):47-48.

[2] 馬海港,張汝學(xué),賈正平.IR動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志,2008,28(1):33-36.

[3] 仝小林,段軍.代謝綜合征的中醫(yī)認(rèn)識和治療[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào),2002,16(5-6):347.

[4] 丁學(xué)屏,陸灝,虞芳華,等.非胰島素依賴型糖尿病中醫(yī)辨證分型與胰高糖素、胰島素敏感性相關(guān)研究[J].上海中醫(yī)藥雜志,1999,33(9):18.

[5] 裴新軍,張靜喆.脂肪細(xì)胞因子與IR關(guān)系的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(16):1201.