碳納米管-表面活性劑修飾的H2O2酶電極

史汶靈，屈永霞，范小雪，張智慧，黃杉生

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

0 引言

酶生物傳感器用于環(huán)境中農藥殘留的檢測，因其具有高度的選擇性、結構簡單、檢測速度快，成本低，利于在線、可應急監(jiān)測而引起人們的越來越多關注。納米材料制備技術、生物技術的發(fā)展為擴展生物傳感器的應用范圍、提高其靈敏度、微型化打下了堅實的基礎，極大地促進了酶生物傳感器的研究與應用[1～3]。

酶生物傳感器用于檢測農藥殘留的原理主要有兩種：（1）利用酶的催化放大作用和免疫分析的高特異性，酶催化底物發(fā)生相應的水解、氧化或還原反應，形成具有電活性的產物，進而采用不同的電分析方法進行測定[4]；（2）利用農藥與酶結合來抑制酶的活性，農藥的濃度與酶被抑制的活性成一定的數(shù)學關系，從而實現(xiàn)對農藥殘留量的檢測[1]。作為生物傳感器關鍵組成物-活性酶的固定技術將直接影響傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度、響應時間和使用壽命等。當前國內外對酶的固定技術進行了廣泛的研究，并取得了許多重要進展[5]。

酶的固定化技術指的是通過某些方式使酶和載體結合，使酶被集中或限制，使之在一定空間范圍內進行催化反應。目前酶的固定方法主要有吸附法[6]、共價鍵結合法[7]、凝膠/溶膠[8]、交聯(lián)法[9]及自組裝法[10]等方法。

基于帶相反電荷膠體微粒的層層 （lay-bylay）自組裝法，由于其具有成膜的有序性，可在分子水平上控制膜的厚度等優(yōu)點，引起人們廣泛的關注。層層自組裝法是生物傳感器研究中一個很重要的生物分子固定化技術，利用該方法酶分子和媒介體可共同固定到電極表面，易于消除干擾，而且生物傳感信號可以放大，酶分子仍然具有其活性[5]。

碳納米管被發(fā)現(xiàn)以來，由于其具有很好的電化學和化學穩(wěn)定性、良好的導電性、大的比表面積和優(yōu)良的電催化性能，能促進電活性物質的電子傳遞等優(yōu)點。碳納米管還可作為固定酶的載體材料，使人們對碳納米管在電化學中的應用產生了極大的興趣[11～14]。但采用共價鍵合法或交聯(lián)法用碳納米管作為固定酶的載體材料時，需要對碳納米管要用強酸（硫酸和硝酸）進行預處理，并且其與酶交聯(lián)時間久。在對碳納米管進行強酸氧化過程中，也許會使碳納米管的結構、長短、或者電子特性發(fā)生難以預料的改變，而且碳納米管難溶于許多溶劑中也給碳納米管-酶傳感器的發(fā)展帶來困擾[15]。

該文描述了一種新的方法來制備酶傳感器。將碳納米管溶解在表面活性劑中，使其表面帶有正/負電荷。根據(jù)酶的等電點，改變溶液的pH值來使酶帶有相反的電荷，再通過自組裝法，制備出新的酶傳感器。這種方法簡單，不需對碳納米管進行酸化。而且酶的活性穩(wěn)定，為制備檢測農藥殘留的生物傳感器提供了一種新的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

CHI 600電化學工作站 (上海辰華儀器有限公司)，采用三電極系統(tǒng)，鉑絲電極作輔助電極，飽和甘汞(SCE)電極為參比電極，銅電極為工作電極；pH計(6219型，上海任氏電子有限公司)。每次測試前試液均通氮氣除氧10 min,實驗中保持氮氣氛圍。所有電化學實驗均在室溫(25℃)下進行。

1.2 試劑及溶液

碳納米管：（MWNTs，φ ＜ 10 nm；長度 0.5～500 μm； 純度 ＞95%，比表面積約為 300 m2/g，深圳市納米港有限公司）。

葡萄糖氧化酶（GOD，上海生工）：10 mg/mL；磷酸緩沖溶液(PBS)：用 0.1 mol/L Na2HPO4和 0.1 mol/L NaH2PO4配制。十六烷基溴化鈉（CTAB,0.85 mg/mL）所有的化學試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 酶-碳納米管-表面活性劑修飾玻碳電極的制備

先將玻碳電極(GC,直徑為4 mm)分別用6號砂紙、0.3 μm、0.1μm 和 0.05 μm Al2O3拋光粉拋光至鏡面，然后分別在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗各3 min。再分別用2 mol/L NaOH,1∶1 HNO3無水乙醇和水超聲清洗。

GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的制備：將30 mg/mL的碳納米管分散在30mL的CTAB（1.0%）水溶液中，超聲分散 5 min，制備成黑色的碳納米管懸濁液（1 mg/mL），以4 000 r/min離心30 min，去除少量的比較長的碳納米管，得到上層CTAB-MWNTs溶液。 移取 10 μL的 CTABMWNTs溶液滴加在干凈的GC電極表面，室溫下?lián)]發(fā)至干。再將CTAB-MWNTs-GC浸泡在GOD（10 mg/mL 的 pH7.0 PBS）中 2.5 h，取出，用二次水徹底沖洗干凈，保存在4℃下,pH7.0 PBS溶液中。

2 結果與討論

2.1 酶-MWNTs-表面活性劑-GC電極的電化學性質

將MWNTs溶解于CTAB水溶液中，制備MWNTs-CTAB-GC電極，使MWNTs表面帶有正電荷，而 GOD 等電點是 4.2，在 pH7.0 PBS 中荷負電，再利用LBL的方法制備GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極。

圖1為不同修飾電極在pH7.0的PBS中的循環(huán)伏安曲線。曲線b是MWNTs-CTAB-GC電極，在-0.36 V處有一對很小的肩峰；曲線a是GOD-MWNTs-CTAB-GC電極在相同的掃描電位下，-0.36 V處的肩峰依然存在，說明此峰是CTAB所產生的，另外還出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰，Epa=-0.434 V,Epc=-0.487 V，ΔEp=53 mV，說明此峰是GOD在電極表面發(fā)生直接電化學所產生的。

2.2 GOD-MWNTs-CTAB-GC電極掃速與峰電流的關系

圖2是GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的循環(huán)伏安曲線與掃速的關系，隨著掃描速度的增加，峰電位差保持一個常數(shù)，約56 mV，陽極峰電流和陰極峰電流與掃描速度呈線性關系，說明電極是受電化學反應控制的。

圖1 GOD-MWNTs-CTAB-GC(a),MWNTs-CTAB-GC(b),在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中的循環(huán)伏安曲線掃速：100 mV/sFig.1 Cycle voltammograms of different modified electrodes in 0.1mol/L PBS（pH7.0）GOD-MWNTs-CTAB-GC(a),MWNTs-CTAB-GC(b),Scan rates:100 mV/s

2.3 pH的選擇

實驗比較了GOD-MWNTs-CTAB-GC電極在各種不同pH值的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的電化學響應(圖3)。實驗發(fā)現(xiàn)修飾電極的氧化還原峰電位隨著pH的增大而負移，峰電流隨著pH的增大先增大后減小，在pH7.0的PBS中峰電流較高，氧化還原峰形較好，故實驗選擇pH7.0的PBS溶液。

2.4 MWNTs用量的選擇

實驗考查了GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極的響應電流與MWNTs用量的關系 （圖4）。響應電流隨著MWNTs用量的增大而增大，當用量超過10 μL時響應電流達到了一個平臺，可能是在不斷增加MWNTs用量的過程中，電極上的活性位點也增加，從而導致響應電流也增高；但當MWNTs濃度再增大時，電極表面上的MWNTs膜達到了飽和，所以響應電流不再增加，所以實驗中選擇10 μL的MWNTs-CTAB溶液。

圖2 (a)GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH7.0)中的循環(huán)伏安曲線；(b)氧化峰電流與還原峰電流與掃描速度的關系。 掃速：20,60,80,100,120 mV/sFig.2 (a)Cycle voltammogram of different scan rate in 0.1 mol/L PBS(pH7.0)；(b)Relation of oxidation and reduction current peaks and scaning rate Scan rate:20,60,80,100,120 mV/s

圖3 GOD-MWNTs-CTAB-GC 在 pH=4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.3 PBS中的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cycle voltammogram of different at GOD-MWNTs-CTAB-GC electrode

圖4 MWNTs用量的影響Fig.4 Effect of concentration of MWNTs

2.5 浸泡時間的選擇

實驗考察了MWNTs-CTAB-GC分別浸泡在GOD 中 0.5 h、 1.0 h、2.0 h、2.5 h 和 3.0 h 時電極的循環(huán)伏安曲線，結果見圖5。剛開始響應電流隨著浸泡在GOD中時間的增長而明顯增大，當浸泡時間為2.5 h時，響應電流不再增大，故實驗中選擇浸泡時間為2.5 h。

圖5 浸泡時間的影響Fig.5 Effect of soaking time

2.6 計時安培法檢測H2O2

在優(yōu)化實驗條件下，用GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極，以安培法來檢測H2O2，結果見圖6。 H2O2濃度在 1.0×10-6～5.4×10-5mol/L 內與響應電流呈線性關系，最低檢測限為5.3×10-7mol/L（3 倍信噪比）。

圖6 GOD-MWNTs-CTAB-GC修飾電極檢測H2O2的安培響應Fig.6 Determination of H2O2by GOD-MWNTs-CTABGC electrode

2.7 回收率的測定

在一定濃度醫(yī)用消毒水中，以上述電極方法進行H2O2含量測定。逐次加入2 μL 0.005 mol/L H2O2標準溶液，測定其回收率，結果列入表1。測定的回收率在95%～104%之間。

表1 樣品的檢測(n=5)Tab.1 The determination results of samples(n=5)

3 結論

該文基于目前酶傳感器制備技術基礎上，研究了一種新的酶固定方法。實驗證明，該方法不需對碳納米管進行酸化、操作簡單、步驟少、酶固定后電極的穩(wěn)定性高并提高了檢測的響應電流，為制備檢測農藥殘留的生物傳感器提供了一種新的方法。

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