納米材料在適體傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展

徐 鳳,常艷兵,張銀烽,陶滿蘭,楊云慧

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650092）

0 引言

納米材料是指材料的基本單元大小限制在1～100 nm范圍的材料。由于其尺寸小而具有的量子效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特性，因此納米材料在催化、磁介質(zhì)、生物醫(yī)藥和生物電分析領(lǐng)域等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[1]。經(jīng)過近幾十年的研究，已經(jīng)制備出了各種形貌的納米材料，比如納米顆粒[2]、納米管[3]、納米線[4]、納米棒[5]、納米帶[6～7]等。

適體是由25～80個堿基組成的能與蛋白質(zhì)、多肽、金屬離子、小分子等特異性結(jié)合的寡核苷酸DNA或RNA鏈。自從1990年Gold[8]和Ellington[9]等實(shí)驗(yàn)室各自獨(dú)立地建立自己的核苷酸文庫并創(chuàng)立一種從超過1015個核苷酸分子文庫里篩選出能與配體專一、高效結(jié)合的DNA或RNA片段的指數(shù)級富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)以后，適體的合成與研究引起了越來越多的科研工作者的關(guān)注。適體的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫反應(yīng)的不足，也為傳統(tǒng)免疫傳感器注入了新的活力。

由于納米材料在比表面和結(jié)構(gòu)上的重要特性,其研究和開發(fā)在近年來得到迅速發(fā)展,特別在適體生物傳感器的研制方面有廣泛的應(yīng)用。納米材料在適體傳感器中的應(yīng)用主要有兩方面：①將納米材料修飾到電極表面用于適體分子的固定；②納米材料作為標(biāo)記物用于檢測。該文將從這兩方面來綜述納米材料最近幾年在適體傳感器中的應(yīng)用。

1 納米材料在適體傳感器中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

1.1 納米材料作為固定材料修飾電極表面

由于納米材料具有比表面積大，電化學(xué)窗口寬，電子傳遞能力高而廣泛應(yīng)用于電極修飾。將納米材料修飾到適體傳感器的表面主要有兩個方面的作用：提高適體分子的固定量和增大電化學(xué)信號。

1.1.1 利用金納米顆粒固定適體

隨著生物化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，目前可以通過商業(yè)途徑購買到按要求修飾的合成寡核苷酸，修飾方式主要是在適體DNA的末端連接含硫化合物，再通過這一基團(tuán)將適體固定在納米金顆粒表面。Chen[10]等研制了一種使用表面增強(qiáng)的拉曼散射光譜來檢測腺苷的適體傳感器。先將金包被的銀溶膠固定到金片表面，然后將一段標(biāo)記了巰基的捕獲探針修飾到傳感器表面，再將抗腺苷的適體與標(biāo)記有四甲基羅丹明的DNA的混合物修飾到傳感器上，最后將腺苷滴到傳感器上，由于腺苷與腺苷適體的特異性結(jié)合導(dǎo)致傳感器上標(biāo)記四甲基羅丹明的DNA釋放到拉曼散射的培養(yǎng)基上，這樣就產(chǎn)生了拉曼散射增強(qiáng)的信號，實(shí)現(xiàn)了對腺苷的檢測。該傳感器的檢測線性范圍是2.0×10-8～2.0×10-6mol/L， 檢測下限為 1.0×10-8mol/L。

Kang等[11]還采用納米金和殼聚糖的混合物修飾電極表面來改善電極的導(dǎo)電性，開發(fā)了一種抗體作為捕獲探針，適體作為檢測探針，亞甲基藍(lán)作為電活性物質(zhì)的凝血酶電化學(xué)適體傳感器(結(jié)構(gòu)如圖1)。該傳感器的檢測下限為0.5 nmol/L，檢測線性范圍為1～60 nmol/L。

Li等[12]將固定到玻碳電極上的金納米顆粒作為固定帶巰基的適體的一個平臺，采用[Fe(CN)6]3-/4-作為檢測探針來檢測傳感器界面電子的轉(zhuǎn)移量。凝血酶的量與電極表面電子轉(zhuǎn)移量在凝血酶濃度為0.12～30 nmol/L成線性關(guān)系。該小組考察了三種不同的適體與凝血酶之間的結(jié)合與分解速率，并證實(shí)了將金納米顆粒沉積到玻碳電極作為固定適體的平臺可以提高傳感器的檢測靈敏度。Feng等[13]設(shè)計了一種檢測腺苷的非標(biāo)記型適體傳感器，采用1,6-硫醇將金納米顆粒固定到金電極表面，固定的金納米顆粒能提高電極表面俘獲探針的量，采用亞甲基藍(lán)作為檢測探針來檢測腺苷的量。該傳感器檢測范圍寬，靈敏度高，傳感器使用超過十次后信號仍能保持到原有信號的90%。Zhao等[14]設(shè)計了一種新型的檢測茶堿的RNA適體傳感器。該小組首先通過電沉積使玻碳電極表面生成金納米顆粒，然后探針RNA通過巰基組裝到金納米顆粒上。該小組用阿霉素作為電化學(xué)檢測探針，通過阿霉素在電極表面的氧化還原情況檢測茶堿的濃度，線性范圍為2.0～50.0 μmol/L,檢測下限為 1.2 μmol/L。Suprun[15]等利用生物素親和素技術(shù)將適體固定到已用金納米顆粒修飾的絲網(wǎng)印刷電極上面，用溶出伏安法在一定電位下將金納米顆粒氧化為金的氧化物，通過檢測金的氧化物的量來測定電極上凝血酶的含量。該方法的檢測下限達(dá)10-9mol/L，線性范圍為 10-8～10-5mol/L（溶液中），2×10-14～2×10-11mol/L（電極上）。

圖1 傳感器制備流程圖[11]Fig.1 Schematic representations of the principle for the sensing steps[11]

1.1.2 利用磁性納米顆粒固定適體

Kawde[16]等首次證實(shí)了核酸適體可以用于電化學(xué)檢測蛋白質(zhì)。該小組首先將生物素標(biāo)記的抗溶菌酶適體結(jié)合到鏈霉親和素化的納米磁珠上，然后再加靶蛋白溶菌酶，由于溶菌酶適體和溶菌酶的特異性結(jié)合導(dǎo)致納米磁珠上溶菌酶適體的解離，用磁性分離從磁珠上解離的溶菌酶適體，最后通過計時電位溶出法檢測溶菌酶適體的量來測定溶菌酶的濃度，該方法對溶菌酶的檢測下限為7 nmol/L。

1.1.3 利用碳納米管固定適體

楊佳等[17]用碳納米管負(fù)載釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記的凝血酶適體Ⅱ，根據(jù)釕聯(lián)吡啶衍生物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的改變采用夾心法檢測凝血酶的濃度，該方法的檢出限為1.3×10-12mol/L。且在對凝血酶濃度為1.0×10-10mol/L的情況下進(jìn)行平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%。李延[18]用單壁碳納米管負(fù)載凝血酶的第二段適體和釕聯(lián)吡啶的復(fù)合物構(gòu)成電化學(xué)發(fā)光檢測探針檢測凝血酶， 該傳感器檢測的線性范圍為 1.0×10-14～1.0×10-11mol/L，檢測下限為 3.0×10-15mol/L，且在凝血酶的濃度為5.0×10-13mol/L的情況下進(jìn)行11次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%。

1.2 納米材料作為標(biāo)記物進(jìn)行檢測

1.2.1 以金納米顆粒為標(biāo)記物

Wang等[19]設(shè)計了一種電化學(xué)發(fā)光適體傳感器來檢測腺苷的濃度。該組將金納米顆粒與電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)釕聯(lián)吡啶形成的絡(luò)合物標(biāo)記作為傳感器的發(fā)光平臺，將二茂鐵標(biāo)記的腺苷適體作為發(fā)光強(qiáng)度控制開關(guān)，通過傳感器的發(fā)光強(qiáng)度來檢測腺苷的濃度。鄭靜等[20]將凝血酶的第二段適體用金膠標(biāo)記后作為檢測信標(biāo)，采用夾心法通過檢測信標(biāo)金膠上的核苷酸鏈與另一段標(biāo)記有金膠的互補(bǔ)鏈進(jìn)一步雜交而實(shí)現(xiàn)金的選擇性富集，金的富集可實(shí)現(xiàn)信號擴(kuò)增而大大提高了傳感器的靈敏度。該傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2，此方法對凝血酶的檢測下限達(dá)4.52×10-15mol/L，且在對凝血酶濃度為7.47×10-14mol/L的情況下平行測定8次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%。

圖2 凝血酶適體生物傳感器示意圖[20]Fig.2 Schematic illustration of the thrombin aptasensor[20](A)Fabrication of the sandwich format bymagnetic nanoparticle labeled aptamerⅠ,thrombin and gold nanoparticle labeled aptamerⅡ;(B)enrichment of gold nanoparticles through the hybridization with the complementary oligonucleotide

Wang等[21]利用凝血酶為模型設(shè)計了一種利用金納米顆粒和適體組合的適體傳感器，原理是將用染料標(biāo)記的DNA和標(biāo)記有金納米顆粒的適體雜交，利用金納米顆粒的熒光淬滅程度實(shí)現(xiàn)凝血酶的檢測，該組設(shè)計了三種模型并認(rèn)為通過自組裝將適體和金納米顆粒固定到電極上是最好的模型。Wang等[22]將納米顆粒和適體相結(jié)合采用表面等離子共振的方法靈敏的檢測了人類免疫球蛋白E(IgE)。該傳感器利用了金納米顆粒對檢測信號的放大作用，檢測下限為1 ng/mL。Zheng等[23]同時利用了磁性納米顆粒和金納米顆粒開發(fā)了一種快速高效靈敏檢測凝血酶的適體傳感器。該文用磁性納米顆粒固定適體，用金納米顆粒標(biāo)記互補(bǔ)核苷酸鏈，將適體與互補(bǔ)核苷酸的雜交體系作為探針，由于凝血酶的引入，導(dǎo)致探針結(jié)構(gòu)破壞，標(biāo)記金納米顆粒的互補(bǔ)核苷酸被釋放出來，再將游離出來的金納米顆粒氧化為AuCl4-，最后用差分脈沖法檢測AuCl4-的信號來檢測凝血酶的濃度。該方法的優(yōu)越性在于能簡單快速而靈敏的檢測凝血酶并由于不需要標(biāo)記凝血酶而可以用于復(fù)雜體系真實(shí)樣品的檢測。

1.2.2 以量子點(diǎn)為標(biāo)記物

Yang等[24]利用CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記凝血酶第二段適體，采用夾心法依次將凝血酶的第一段適體、凝血酶、標(biāo)記量子點(diǎn)的第二段適體固定到金電極表面，然后通過在硝酸溶液中用方波溶出伏安法來檢測Cd2+的濃度來測定凝血酶的濃度，且該傳感器在凝血酶濃度為1 pmol/L時平行測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.3%。 Huang[25]等設(shè)計了一種采用量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光檢測凝血酶的適體傳感器。首先將巰基標(biāo)記的凝血酶第一段適體固定到金電極上，然后將目標(biāo)物凝血酶結(jié)合到適體1上，接著向電極上滴加用生物素標(biāo)記的凝血酶適體2，這樣電極上就形成了適體1/凝血酶/適體2的夾心結(jié)構(gòu)。最后將鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)被加到電極上與適體2形成生物素-親和素體系，量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)弱反應(yīng)了電極上凝血酶的濃度，該傳感器檢測的線性范圍為0～20 μg/mL,且該傳感器選擇性好，性能穩(wěn)定。

2 展望

納米材料是一種性能優(yōu)異的功能材料，應(yīng)用開發(fā)的前景十分廣闊。將納米材料應(yīng)用于適體傳感器為適體傳感器的發(fā)展提供了巨大的空間。與傳統(tǒng)的傳感器相比，基于納米材料的適體傳感器具有超高的靈敏度和良好的選擇性，且可實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時檢測分析。但是由于一些納米材料合成困難以及適體的篩選耗時，篩選過程復(fù)雜等不利因素制約了基于納米材料的適體傳感器的發(fā)展。隨著納米技術(shù)和傳感器技術(shù)的發(fā)展，如何將納米科學(xué)和適體傳感器有機(jī)的結(jié)合，如何利用納米材料的特殊性能來提高適體傳感器的檢測靈敏度和檢測通量是科研工作者努力的方向和研究的熱點(diǎn)，也是適體傳感器發(fā)展的新方向之一。

[1]Kerner E H.Dynamical Feynman's Theorem[J].Phys.Rev.Lett.,1959,2(4):152～153.

[2]Nelson E J,Samulski E T.Preparation of CdS nanoparticles within an ordered polypeptide matrix [J].Mater.Sci.Eng.C,1995,2(3):133～140.

[3]Iijima S.Helical microtubules of graphitic carbon[J].Nature,1990,347(11):56～58.

[4]Liu J,Lin Y H,Liang L,et al.Templateless assembly of molecularly aligned conductive polymer nanowires:a new approach for oriented nanostructures[J].Chem.Euro.J.,2003,9(3):605～611.

[5]K?nekamp R,Word R C,Dosmailov M,et al.Pentagonal ZnO nanorods[J].Phys.Status Solidi(RRL),2007,1(3):101～103.

[6]Pan Z W,Dai Z R,Wang Z L.Nanobelts of semiconducting oxides[J].Science,2001,291(5 510):1 947～1 949.

[7]Xu L,Su Y,Cai D,et al.Synthesis and photoluminescence properties of CdS nanobelts [J].Mater.Lett.,2006,60(11):1 420～1 424.

[8]Tuerk C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,249(4 968):505～510.

[9]Ellington A D,Szostak J W.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature，1990,346(6 287):818～822.

[10]Chen J W,Liu X P,Feng K J,et al.Detection of adenosine using surface-enhanced Raman scattering based onstructure-switching signaling aptamer[J].Biosens.Bioelectron.,2008,24(1):66～71.

[11]Kang Y,Feng K J,Chen J W,et al.Electrochemical detection of thrombin by sandwich approach using antibody and aptamer[J].Bioelectrochem.,2008,73(1):76～81.

[12]Li X X,Shen L H,Zhang D D,et al.Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J].Biosens.Bioelectron.,2008,23(11):1 624～1 630.

[13]Feng K J,Sun C H,Kang Y,et al.Label-free electrochemical detection of nanomolar adenosine based on target-induced aptamer displacement [J].Electrochem.Commun.,2008,10(4):531～535.

[14]Zhao G C,Yang X.A label-free electrochemical RNA aptamer for selective detection of theophylline[J].Electrochem.Commun.,2010,12(2):300～302.

[15]Suprun E,Shumyantseva V,Bulko T,et al.Au-nanoparticles as an electrochemical sensing platform for aptamer-thrombin interaction [J].Biosens.Bioelectron.,2008,24(4):825～830.

[16]Kawde A N,Rodriguez M C,Lee T M H,et al.,Labelfree bioelectronic detection of aptamer-protein interactions[J].Electrochem.Commun.,2005,7(5):537～540.

[17]楊佳.基于適體均相電化學(xué)發(fā)光法檢測凝血酶的研究[D].陜西:陜西師范大學(xué)，2008.

[18]李延.電化學(xué)發(fā)光DNA和適體生物傳感器的研究[D].陜西:陜西師范大學(xué)，2008.

[19]Wang X Y,Dong P,He P G,et al.A solid-state electrochemiluminescence sensing platform for detection of adenosine based on ferrocene-labeled structure-switching signaling aptamer[J].Anal.Chim.Acta.,2010,658(2):128～132.

[20]鄭靜，馮婉娟，黃翠華，等.利用互補(bǔ)核酸雜交富集金膠實(shí)現(xiàn)信號擴(kuò)增的電化學(xué)凝血酶蛋白生物傳感器研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,2007,28(12):2 274～2 279.

[21]Wang W J,Chen C L,Qian M X,et al.Aptamer biosensor for protein detection using gold nanoparticles[J].Anal.Biochem.,2008,373(2):213～219.

[22]Wang J L,Munir A,Li Z H,et al.Aptamer-Au NPs conjugates-enhanced SPR sensing for the ultrasensitive sandwich immunoassay[J].Biosens.Bioelectron.,2009,25(1):124～129.

[23]Zheng J,Cheng G F,He P G,et al.An aptamer-based assay for thrombin via structure switch based on gold nanoparticles and magnetic nanoparticles[J].Talanta,2010,80(5):1 868～1 872.

[24]Yang H,Ji J,Liu Y,et al.An aptamer-based biosensor for sensitive thrombin detection[J].Electrochem.Commun.,2009,11(1):38～40.

[25]Huang H P,Zhu J J.DNA aptamer-based QDs electrochemiluminescence biosensor for the detection of thrombin[J].Biosens.Bioelectron.,2009,25(4):927～930.