發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病抑制機(jī)理研究

王芳，何永棟，何小莉

（1．寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，寧夏銀川，750002；2.紅寺堡開發(fā)區(qū)農(nóng)牧局農(nóng)技中心；3.寧夏石嘴山市草原工作站）

發(fā)酵沼液是由人、畜糞便及農(nóng)作物秸稈等各種有機(jī)物經(jīng)厭氧發(fā)酵后的殘留物，是一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)物，它不僅含有極其豐富的植物所需的多種營(yíng)養(yǎng)元素和大量的微生物代謝產(chǎn)物，而且含有抑菌和提高植物抗逆性的激素、抗生素等有益物質(zhì)，可用于防治植物病蟲害和提高植物抗逆性[1]，其作為一種廢渣廢水再利用、易獲取的有機(jī)農(nóng)藥在防病抗蟲方面有絕對(duì)的研究開發(fā)和推廣使用價(jià)值[2]。本試驗(yàn)通過室內(nèi)毒力測(cè)定，研究了發(fā)酵沼液對(duì)致病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)的影響，及田間防治試驗(yàn)等系統(tǒng)抑制機(jī)理，明確發(fā)酵沼液對(duì)灰霉病菌的抑菌機(jī)理和防治效果，以期變廢為寶，為發(fā)酵沼液在作物病蟲害防治開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌制備

黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.），從田間采集病樣，采用真菌分離法[3]，分離純化獲得菌種，保存在4℃恒溫培養(yǎng)箱中備用。

1.2 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用含毒介質(zhì)法測(cè)定[4]。在無菌條件下，將發(fā)酵沼液或50%腐霉利WP按一定比例加入培養(yǎng)皿（直徑＝90 mm）后，迅速倒入經(jīng)滅菌后冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基，混勻，制成含藥平板待用，以空白PDA培養(yǎng)基平板和加50%腐霉利WP的為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。待平板凝固后接入生長(zhǎng)一致的菌餅（直徑＝6.0 mm），置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h，用十字交叉法測(cè)1次菌落直徑，直至對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。用下列公式計(jì)算抑菌率：

菌落直徑（mm）＝測(cè)量菌落平均值－6.0；抑菌率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/處理菌落直徑×100%。

1.3 對(duì)孢子形成的影響

將上述培養(yǎng)72 h的各處理和對(duì)照菌落上的孢子洗下，用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)孢子數(shù)，每處理重復(fù)計(jì)數(shù)3次。用下列公式計(jì)算形成孢子的數(shù)量及對(duì)孢子形成的抑制率[3]：

孢子數(shù)＝孢子平均數(shù)×4 000 000；孢子形成抑制率 （%）＝（對(duì)照孢子數(shù)－處理孢子數(shù)）/對(duì)照孢子數(shù)×100%。

1.4 對(duì)孢子萌發(fā)的影響

采用載玻片萌發(fā)法[5]測(cè)定發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用，在適宜的溫度（20℃）下保濕（濕度95%）培養(yǎng)，觀察孢子萌發(fā)情況，以滅菌水作對(duì)照，重復(fù)3次。分別于第2，4，6，8，10 h在顯微鏡下檢查孢子萌發(fā)情況，當(dāng)對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)60%以上時(shí)，每處理觀察100個(gè)孢子，以可見芽管為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)各處理萌發(fā)率。

表1 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

孢子萌發(fā)率 （%）＝萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%；孢子萌發(fā)抑制率（%）＝（對(duì)照孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.5 對(duì)分生孢子及菌絲的影響

將抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)的各處理和對(duì)照菌落，在恒溫（25℃）下培養(yǎng)72 h后，用挑針挑取病原菌菌落邊緣的菌絲體和正常菌絲體制成玻片標(biāo)本，在顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)下觀察不同濃度的發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌分生孢子及菌絲形態(tài)的影響[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明（表1），發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌有顯著的抑制作用，尤其是原液，在施藥后72 h時(shí)抑菌率達(dá)86.94%，隨施藥時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用不斷增強(qiáng)。稀釋1倍的沼液隨施藥時(shí)間的延長(zhǎng)其抑菌作用亦在增加，72 h時(shí)抑菌率為84.82%。稀釋2倍、4倍、8倍的沼液在施藥后48 h表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制作用，72 h時(shí)抑制作用下降。稀釋16倍的沼液在72 h時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制作用，抑菌率為61.48%。發(fā)酵沼液原液、稀釋1倍、2倍在施藥后48 h內(nèi)對(duì)病原菌的抑制作用與對(duì)照藥劑50%腐霉利可濕性粉劑相當(dāng)。從表1可以看出，隨著發(fā)酵沼液稀釋倍數(shù)的增加，其對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制作用在降低。

2.2 對(duì)孢子形成的影響

發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子的形成具有明顯的抑制作用（圖1、圖3），其對(duì)灰霉病菌孢子形成的抑制率隨稀釋倍數(shù)的增加而降低。發(fā)酵沼液稀釋到16倍時(shí)，處理組產(chǎn)生的孢子數(shù)為對(duì)照（280 000）的78.57%，原液處理過的灰霉菌產(chǎn)生的孢子數(shù)僅為對(duì)照的10.71%，抑制率高達(dá)89.29%，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用。

2.3 對(duì)孢子萌發(fā)的影響

載玻片萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果表明（圖2、圖4），發(fā)酵沼液原液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)78.57%，隨發(fā)酵沼液稀釋倍數(shù)的增加，其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用降低，發(fā)酵沼液稀釋到16倍時(shí)對(duì)灰霉菌的抑制率僅為7.74%。

2.4 對(duì)分生孢子及菌絲的影響

通過顯微可視攝像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)（圖5、圖6），經(jīng)發(fā)酵沼液處理的黃瓜灰霉病菌菌絲與對(duì)照存在差異。處理組菌絲發(fā)生斷裂、扭曲、分枝增多，而對(duì)照菌絲生長(zhǎng)正常，未見斷裂、扭曲現(xiàn)象。處理組產(chǎn)生的分生孢子數(shù)量明顯少于對(duì)照。

圖1 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子形成的影響

圖2 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響

圖3 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子形成的抑制作用

圖5 未經(jīng)發(fā)酵沼液處理的灰霉菌孢子

圖6 經(jīng)過發(fā)酵沼液處理的灰霉菌孢子

表2 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病田間藥效試驗(yàn)

2.5 對(duì)黃瓜灰霉病的田間防治效果

通過田間試驗(yàn)（表2）可以看出，發(fā)酵沼液在大田中對(duì)黃瓜灰霉病防治效果較差。發(fā)酵沼液選用的稀釋1倍、2倍、4倍在第1次施藥后4 d對(duì)灰霉病的防效分別為47.23%，38.25%，35.17%，在第2次施藥后4 d防效分別為25.07%，19.08%，11.44%，防治效果均下降，且試驗(yàn)區(qū)藥前平均病情指數(shù)為1.29，第1次藥后4 d時(shí)病情指數(shù)上升到1.57，第2次藥后4 d病情指數(shù)上升到2.95。說明發(fā)酵沼液只減緩了灰霉病的發(fā)病進(jìn)程，并未起到控制作用。對(duì)照藥劑50%腐霉利可濕性粉劑對(duì)黃瓜灰霉病有一定的控制作用，在第2次藥后4 d防效達(dá)69.92%。經(jīng)顯著性分析，各個(gè)處理在0.05和0.01水平上均差異顯著。

圖4 發(fā)酵沼液對(duì)黃瓜灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵沼液在室內(nèi)對(duì)黃瓜灰霉病菌有很好的抑制作用，且對(duì)灰霉病菌孢子形成及萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，鏡檢觀察到發(fā)酵沼液造成灰霉病菌菌絲發(fā)生斷裂、扭曲、分枝增多，產(chǎn)生的分生孢子數(shù)量明顯少于對(duì)照。結(jié)合藥前、藥后的病情指數(shù)分析得出，發(fā)酵沼液在田間對(duì)黃瓜灰霉病只減緩了其發(fā)病進(jìn)程，并未起到控制作用。

在室內(nèi)毒力測(cè)定中觀察到，發(fā)酵沼液由于成分復(fù)雜，污染較嚴(yán)重，在藥后72 h已無法繼續(xù)調(diào)查，這或許也是發(fā)酵沼液在室內(nèi)對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制作用較好的原因。

發(fā)酵沼液是一種復(fù)雜的有機(jī)、無機(jī)營(yíng)養(yǎng)和微生物及其代謝產(chǎn)物的混合群體，因此，其對(duì)植物病害的抑制作用可能是多效疊加和選擇性的結(jié)果，而無法明確具體抑菌因子。

[1]董曉濤，楊志，周淑鳳.沼液對(duì)黃瓜白粉病的防治效果研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，8（3）：25-26.

[2]吳尚作.沼液增產(chǎn)技術(shù)的研究推廣[J].中國(guó)沼氣，1997，15（1）：35-37.

[3]方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[4]黃彰欣.植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1990.

[5]慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[6]張新虎，何靜，沈慧敏.蒼耳提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用及抑制機(jī)理初探[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：99-104.