過氧化氫浸種對莖瘤芥種子萌發(fā)的影響

何士敏，李昌滿，于文博

（長江師范學院生命科學與技術學院，重慶涪陵，408100）

莖瘤芥 （Brassica junceaCoss.var.tumida Tsen et Lee）的瘤莖表皮青綠光滑，皮下肉質色白而肥厚，質地脆嫩。瘤莖部分，即青菜頭，一般每個質量0.5 kg左右，大者1～1.5 kg。莖瘤芥用途十分廣泛，煮熟的青菜頭拌上調料食用十分可口；其煮后的湯有一種雞湯式的鮮味。用青菜頭制成的泡菜，顯得嫩脆別致。現(xiàn)代科學化驗證明，它的營養(yǎng)十分豐富，每500 g青菜頭含有蛋白質 20.5 g、糖 45 g、鈣 1 400 mg、磷 650 mg、鐵 33.5 mg。莖瘤芥還是做榨菜的主要原料，現(xiàn)代營養(yǎng)學認為，榨菜能健脾開胃、補氣添精、增食助神；低鹽保健型榨菜還能起到保肝減肥的作用；榨菜有“天然暈海寧”之說，暈車暈船者在口中放一片榨菜咀嚼，會使煩悶情緒緩解；飲酒不適或過量時，吃一點榨菜可以緩解酒醉造成的頭昏、胸悶和煩躁感[1]。因此，莖瘤芥在人們日常生活中的地位是很重要的。目前，加強我國莖瘤芥種子生產和種子活力方面的研究已經(jīng)引起研究人員的高度重視，如果在堅持良種繁育和品種復壯的同時，又采取提高種子活力的措施，則能大大提高我國莖瘤芥的產量。

過氧化氫作為種子萌發(fā)促進劑，以價格低廉、使用方便，在科研和農業(yè)生產上得到廣泛應用[2～3]。因此，本文研究了不同濃度的過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)的影響，探討提高莖瘤芥種子活力的途徑，旨在為莖瘤芥生產實踐提供一些科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的莖瘤芥種子有：涪陵早豐、鵝公雪松和永安小葉等3個品種，由重慶涪陵何亞種子經(jīng)營部供種。

1.2 試驗方法

①種子發(fā)芽試驗 取15套中等型號的培養(yǎng)皿，分為3個組，每組5套，在每個培養(yǎng)皿中放入籽粒飽滿、顏色健康的莖瘤芥種子50粒，再用適量（剛好浸沒種子上表面）蒸餾水（對照），0.01%，0.1%，1%，3%的 H2O2溶液分別浸泡，加蓋，處理12 h。將浸種后的種子洗凈，置于經(jīng)高壓滅菌、墊有2層濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，并加入適量蒸餾水，在25℃光照下進行萌發(fā)試驗，每天記載發(fā)芽種子數(shù)，并用蒸餾水清洗1次種子。

試驗過程中統(tǒng)計供試種子數(shù)、逐日實際發(fā)芽數(shù)和平均苗長（m），計算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值、活力指數(shù)[2]。a.發(fā)芽指標測定。發(fā)芽后測定過氧化物酶活性和多酚氧化酶活性。發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）（Gt為 t時間內的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)）[4]；活力指數(shù)=平均苗長×發(fā)芽指數(shù)。

b.過氧化物酶（POD）活性測定。參照俞建英等[7]的方法，略有改動。稱取經(jīng)處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g，加20 mmol/L KH2PO45 mL，于研缽中冰浴研磨成勻漿，以4 000 r/min離心15 min，收集上清夜保存在冷處，所得殘渣再用5 mL KH2PO4溶液提取1次，合并2次上清液作為酶液保鮮備用。取光徑1 cm比色杯2只，于1只中加入反應混合液3 mL，KH2PO40.5 mL，作為校零對照，另1只中加入反應混合液3 mL，上述酶液0.5 mL，立即開啟秒表記時，于分光光度計470 nm波長下測量OD值，每隔1 min讀數(shù)1次，一共讀5 min。以平均每分鐘OD的變化量表示酶活性大小。

c.多酚氧化酶（PPO）活性測定。參照李敏等[8]的方法，略有改動。稱取經(jīng)不同處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g，加pH值7.6的磷酸緩沖液10 mL，在研缽中冰浴研磨成勻漿轉入離心管，以4 000 r/min離心15 min，取其上清液作為酶液。然后取2只光徑1 cm的比色杯，于1只中加入pH值磷酸緩沖液1 mL，0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL，作為校零對照。另1只中加入pH值7.6磷酸緩沖液1 mL，0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL，上述酶液0.5 mL，用分光光度計在波長410 nm條件下測定OD值，每5 s記錄1次。酶活力單位為每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。

②過氧化氫對種子電解質外滲率的影響 參照張志良[5]的方法，略有改動。先測定活種子外液電導率：對3個品種的莖瘤芥種子分別用適量蒸餾水，0.01%，0.1%，1%，3%H2O2浸泡處理 24 h，然后取處理后的種子各50粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干。最后將種子放入500 mL錐形瓶中，加蒸餾水250 mL，保持24 h，搖動錐形瓶，使溶液均勻，過濾到250 mL燒杯中，用DDS_11A型電導率儀測定溶液的電導率。

其次，測定死種子外液電導率：分別用蒸餾水，0.01%，0.1%，1%，3%H2O2溶液對 3 個品種的莖瘤芥種子進行浸泡處理24 h，取處理后的種子各50粒，用蒸餾水洗凈，再用濾紙吸干，將種子放在500 mL燒杯中，加蒸餾水250 mL，在電爐上加熱20 min將其煮死，待溶液冷卻之后，滴加蒸餾水至加熱前的刻度，以補充蒸發(fā)掉的水分，搖動燒杯，使溶液均勻，再過濾到250 mL燒杯中，測定溶液的電導率。

電解質外滲率（%）=活種子外液電導率/煮死種子外液電導率×100%[6]。

圖1 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽率的影響

2 結果與分析

2.1 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)的影響

①發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的變化 a.采用不同濃度的過氧化氫浸種處理3個品種的莖瘤芥種子，隨著過氧化氫濃度的不斷增加，3個品種的種子發(fā)芽率均先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過氧化氫處理種子，可以使其發(fā)芽率升高，當濃度為0.1%時，發(fā)芽率達到最高值；0.1%以上濃度的過氧化氫明顯抑制種子的萌發(fā)，降低種子的發(fā)芽率。b.3個品種的種子，與對照相比，經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率最大增幅為21個百分點，永安小葉種子的發(fā)芽率最大增幅為17個百分點，而鵝公雪松種子的發(fā)芽率最大增幅為10個百分點，說明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率效果最佳（圖1）。

不同濃度的過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響和對發(fā)芽率的影響基本一致（圖1，圖2）。

②發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)的變化 從圖3可以看出，a.隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高，3個品種的種子發(fā)芽率高峰值先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過氧化氫處理種子，可以使種子發(fā)芽率高峰值升高，當濃度為0.1%時，發(fā)芽率高峰值達到最高；而0.1%以上濃度的過氧化氫明顯降低了種子的發(fā)芽率高峰值。b.3個品種的種子，與對照相比，經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值最大增幅為9個百分點，永安小葉為7個百分點，而鵝公雪松為8個百分點，這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值效果最佳。

圖2 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響

從圖4可以看出：a.隨著過氧化氫處理濃度的不斷升高，3個品種的種子活力指數(shù)先升高后降低，0.01%～0.1%濃度的過氧化氫可以提高莖瘤芥種子的活力指數(shù)，當濃度為0.1%時，其活力指數(shù)達到最高值；而過氧化氫濃度超過0.1%時則開始降低種子的活力指數(shù)。b.3個品種的種子，與對照相比，經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后，涪陵早豐種子的活力指數(shù)最大增幅為127%、永安小葉為74%、而鵝公雪松種子的活力指數(shù)最大增幅為76%，這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的活力指數(shù)效果最佳。

綜上所述，0.1%的過氧化氫處理的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽高峰值以及活力指數(shù)均最高，這表明，0.1%的過氧化氫對提高種子活力具有一定作用。3個品種的種子，經(jīng)過氧化氫浸種之后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大，這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子活力效果最好。

圖3 過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽率高峰值的影響

圖4 過氧化氫對莖瘤芥種子活力指數(shù)的影響

圖5 過氧化氫對莖瘤芥種子電解質外滲率的影響

圖6 過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)期POD活性的影響

2.2 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子電解質外滲率的影響

從圖5可以看出，隨著過氧化氫處理的濃度不斷升高，3個品種的種子電解質滲透率逐漸升高，這表明過氧化氫可以腐蝕和軟化種皮，增加種皮的通透性，軟化和通透性增加的種皮，不僅有利于萌發(fā)代謝時的水分、氧氣和二氧化碳的吸收交換，更有助于胚芽破皮萌發(fā)。

2.3 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)期POD活性的影響

從圖6可以看出，隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高，3個品種的種子萌發(fā)期的POD活性先升高后降低，0.01%～0.1%的過氧化氫處理種子，可以使種子萌發(fā)芽的POD活性升高，當濃度為 0.1%時，其POD活性達到最高；當處理濃度超過0.1%時，POD活性逐漸降低。

2.4 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)期PPO活性的影響

從表1可以看出，隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高，3個品種的種子萌發(fā)期的PPO活性先升高后降低，0.01%的過氧化氫處理的種子，其PPO活性最高；當處理濃度超過0.01%時，PPO活性逐漸降低。

表1 不同濃度H2O2對莖瘤芥種子多酚氧化酶活性的影響

綜上所述，一定濃度的過氧化氫浸種不僅可以提高種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)，還可提高一些相關酶的活性。分析其原因認為，這是一個由內到外的表現(xiàn)過程，當種子機體內的酶活性提高和代謝加強時，外在就表現(xiàn)出發(fā)芽率和活力指數(shù)相應的升高。

表2 莖瘤芥種子活力指數(shù)與其酶活性的相關系數(shù)

2.5 莖瘤芥種子活力指數(shù)與其POD和PPO活性的相關性

由表2可以看出，莖瘤芥種子活力指數(shù)與 POD活性相關系數(shù)較大，呈顯著的正相關（r=0.862 1），其中POD活性可能是決定種子活力大小的主要因素之一。

3 結論

①0.1%的過氧化氫處理的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值以及活力指數(shù)均最高，這表明，0.1%的過氧化氫對提高種子活力具有一定作用。

②3個品種的種子，經(jīng)過氧化氫浸種之后，涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大，這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子活力效果最好。

③0.01%過氧化氫處理的種子，其多酚氧化酶活性最高；0.1%過氧化氫處理的種子，其過氧化物酶活性最高。這表明適宜濃度的過氧化氫浸種可以提高種子的相關酶活性。

4 討論

過氧化氫在適當濃度下具有促進作物種子萌發(fā)的作用。傳統(tǒng)觀點認為它可輕度腐蝕種（果）皮，提高其透性，為種子提供充足的氧氣而解除休眠[9]。但徐是雄等[10]指出，過氧化氫主要是刺激胚乳物質代謝-磷酸戊糖途徑，它對解除種子休眠具有重要作用。通過本文的研究表明，一定濃度過氧化氫不僅促進種子的萌發(fā)，提高其活力指數(shù)，還提高種子物質代謝水平上相關酶活性，因此可認為，過氧化氫促進種子萌發(fā)與物質代謝密切相關。

適宜濃度過氧化氫浸種處理的莖瘤芥種子，其發(fā)芽率和過氧化物酶、多酚氧化酶活性明顯高于對照處理，表明種子的物質代謝水平由于受到過氧化氫刺激而發(fā)生改變。代謝的改變調節(jié)主要在4個水平上進行：細胞水平、酶水平、激素水平和神經(jīng)水平，其中酶水平的調節(jié)是所有生物最基本的調節(jié)。酶水平的調節(jié)又包括酶活和酶量的調節(jié)，本文認為，過氧化氫浸種提高種子萌發(fā)期的酶活性屬于酶含量的調節(jié)，但也不排除屬于酶活性調節(jié)的可能性。過氧化氫作為氧化劑，它可直接調控蛋白激酶及磷酸酯酶的活性[11～12]，并可以與DNA上的反應元件直接相互作用，這樣便可以選擇誘導許多相關基因的表達，從而可以增加酶含量，以提高自身的免疫能力以及代謝水平，代謝得到提高和加強，種子中的貯藏物質加快轉化為簡單的化合物運輸?shù)秸谏L的幼苗中，提供幼苗生長需要的物質和能源。物質轉化率越高對幼苗的生長越有利，并可以提高幼苗抗逆性[6]，所以外在表現(xiàn)出種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)以及相關酶的活力得到提高。

任何代謝水平的調節(jié)，都必須作用于細胞并通過信號轉導系統(tǒng)而發(fā)揮作用，過氧化氫作為植物中可能存在的新的信號分子，是否以第一信使和第二信使2種形式同時存在，是一個令人感興趣的問題[6]，所以過氧化氫對種子萌發(fā)、活力的提高機理還有待進一步研究和探討。

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