白羊草真葉愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生

于娜,董寬虎

(1.山西省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林系,山西 太原 030009;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

白羊草真葉愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生

于娜1,董寬虎2

(1.山西省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林系,山西 太原 030009;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

在已建立白羊草無(wú)菌苗體系基礎(chǔ)上,采用7日齡真葉為外植體,進(jìn)行組織培養(yǎng),目的在于建立更多受體材料,完善白羊草植株再生體系。結(jié)果表明,在愈傷誘導(dǎo)階段KT的作用明顯,其與2,4-D的交互作用優(yōu)于ABA與2,4-D,也高于單獨(dú)使用2,4-D,在2,4-D 1.0 mg?L-1+KT 0.5 mg?L-1時(shí)誘導(dǎo)率最大,達(dá)到93.45%;分化階段6-BA 0.1 mg?L-1與NAA 0.04-0.06 mg?L-1的激素組合中分化率差異不明顯;12 d左右產(chǎn)生叢生芽,以先長(zhǎng)芽,后長(zhǎng)根的方式開(kāi)始發(fā)育,3～4周形成綠色分化植株,即可煉苗后移栽,植株生長(zhǎng)良好。

白羊草;真葉;胚性愈傷;植株再生

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是禾本科孔穎草屬多年生草本植物[1],是優(yōu)良的牧草和水土保持植物,具有固土保水,生活力強(qiáng),高產(chǎn)耐牧、耐踐踏,適口性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是飼用價(jià)值較高的放牧型禾本科草類之一,廣泛分布于我國(guó)暖溫帶落葉闊葉林地帶,是控制水土流失和維持丘陵山地的原生態(tài)平衡的重要草種[2,3]。

目前關(guān)于白羊草組培再生體系的研究較少,僅20世紀(jì)90年代肖輔珍等[4]分別以白羊草成熟胚和幼穗為外植體進(jìn)行了愈傷誘導(dǎo),繼代增殖轉(zhuǎn)至無(wú)激素培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生植株,轉(zhuǎn)至之前愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響再生植株的誘導(dǎo)頻率。本研究在以白羊草成熟胚為外植體材料,成功建立植株再生體系的基礎(chǔ)上[5],以真葉切段作為材料,進(jìn)行了不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)真葉切段愈傷組織形成和再生苗分化條件的研究,以期為白羊草再生體系的建立提供更多受體材料,并建立愈傷組織形成和植株再生的試驗(yàn)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的白羊草種子2006年10月采自山西省太谷縣鳳山,海拔1100 m,植被為喜暖灌草叢類草地,建群種為白羊草(Bothriochloa ischaemum),千粒重0.6975 g[6]。

1.2 方法

1.2.1 白羊草真葉的預(yù)處理

選擇結(jié)構(gòu)完整、完全成熟的白羊草種子,人工撥去外稃,用無(wú)菌水浸泡10 min,去除雜質(zhì)并使其沉淀,接著用75%酒精浸泡30 s,無(wú)菌水沖洗3次,然后用0.1%二氯化汞溶液消毒15 min,期間不斷搖動(dòng),再用無(wú)菌水沖洗3～4次后濾紙吸干水漬。滅菌過(guò)的成熟種子接種于僅含瓊脂不含任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照強(qiáng)度2000～3000 lx,光周期為16 h?d-1,7 d后用消毒刀鑷截取真葉(長(zhǎng)度1.0～1.5 cm),接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上(見(jiàn)表1),30 d后比較不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體的出愈數(shù)。

表1 真葉外植體的培養(yǎng)基及成分Table 1 Medium and composition of hypocotyls explant

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將切取的真葉接種到附加不同濃度2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、ABA(脫落酸)、KT(激動(dòng)素)激素組合1～11號(hào)的11種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每瓶25個(gè)真葉,重復(fù)3次,置于(25±2)℃,完全黑暗條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。將誘導(dǎo)出的愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖和繼代培養(yǎng)。

1.2.3 愈傷組織的分化及移栽

將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)至附加不同濃度組合6-BA(6-芐基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)的 12～14號(hào)分化培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照強(qiáng)度2000～3000 Lx,光周期16 h?d-1的光照條件下進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng),30 d后統(tǒng)計(jì)分化率,待苗長(zhǎng)到7 cm以上時(shí),轉(zhuǎn)移到不含任何附加成分的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)根的形成。待根系長(zhǎng)至10 cm左右時(shí),去掉三角瓶蓋,內(nèi)加少許水,煉苗3 d后完全洗去附在根上的培養(yǎng)基,晾干水分后移栽至菜園土:腐殖質(zhì):沙土1∶1∶1的花盆中,在溫室條件下生長(zhǎng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

出愈率=產(chǎn)生愈傷組織塊數(shù)/接種種子數(shù)×100%

分化率=出芽愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)×100%

1.2.5 基本培養(yǎng)基

本試驗(yàn)以MSB培養(yǎng)基加3%蔗糖,加5%瓊脂粉制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基,pH值調(diào)至5.8,在121℃條件下滅菌20 min。在基本培養(yǎng)基上附加不同水平的激素。

MSB培養(yǎng)基:MS無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)成分

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 不同2,4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1可看出,單獨(dú)使用2,4-D時(shí)差異性顯著,以2.0 mg?L-1時(shí)誘導(dǎo)率最高,且愈傷生長(zhǎng)較快,多淺黃色,質(zhì)地比較致密。說(shuō)明2,4-D是真葉外植體誘導(dǎo)愈傷的一個(gè)重要因素。

圖1 不同2,4-D濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of callus induction under different 2,4-D

2.1.2 不同KT濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖2可看出,在含適量KT的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,隨著2,4-D濃度由1.0 mg?L-1逐漸上升至6.0 mg?L-1,愈傷誘導(dǎo)率差異不明顯,以4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最大,達(dá)到93.45%,說(shuō)明KT也是誘導(dǎo)的主要因素。

2.1.3 不同ABA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖3可看出,2,4-D和ABA的組合中,保持2,4-D濃度不變,ABA濃度在0.2～1.5 mg?L-1范圍內(nèi)變化時(shí),差異不顯著,誘導(dǎo)率最高只達(dá)到40.28%,明顯低于KT和2,4-D的激素組合,以及單獨(dú)使用2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。說(shuō)明2,4-D在所設(shè)范圍內(nèi),ABA任一水平下愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著,表明ABA對(duì)提高愈傷組織的誘導(dǎo)率可能不是一個(gè)重要因子。

圖2 不同KT濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of callus induction under different KT

圖3 ABA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of callus induction under different ABA

試驗(yàn)中采用單獨(dú)使用2,4-D,KT和2,4-D、ABA與2,4-D的激素組合誘導(dǎo)愈傷組織。結(jié)果表明,在單獨(dú)使用2,4-D時(shí)誘導(dǎo)愈傷差異顯著,加入KT后,交互作用要大于單獨(dú)使用2,4-D,如圖1、圖2。ABA與KT兩者作用亦有差別,從圖2、圖3可以看出含有KT的培養(yǎng)基組合愈傷誘導(dǎo)率要明顯高于含ABA的激素組合。從愈傷質(zhì)量看,在單獨(dú)使用2,4-D的培養(yǎng)基上愈傷生長(zhǎng)較與KT、ABA組合的培養(yǎng)基效果好。

2.2 白羊草愈傷組織的繼代

愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后,由于多為非胚性愈傷,而且出愈傷的部位一般在葉基部,緊密包裹著傷口(見(jiàn)圖5.C),所以需要先在超凈工作臺(tái)上,無(wú)菌條件下用消毒過(guò)的刀鑷剝離愈傷組織,然后再繼代到繼代培養(yǎng)基上,實(shí)現(xiàn)非胚性愈傷向胚性愈傷轉(zhuǎn)化,提高胚性愈傷組織發(fā)生率。

本試驗(yàn)中白羊草成熟胚的胚性愈傷組織只能在形成松軟的非胚性愈傷之后,通過(guò)降低培養(yǎng)基中2,4-D的濃度,使致密或疏松的顆粒中胚性愈傷組織發(fā)生率提高。(見(jiàn)圖5.D)。

2.3 白羊草愈傷組織的分化

繼代一周后接種到分化培養(yǎng)基上。每5 d觀察一次,第5～7 d可以觀察到愈傷組織有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn),兩周后可以觀察叢生芽產(chǎn)生(見(jiàn)圖5.E),真葉愈傷組織上的分化芽無(wú)種子愈傷組織叢生化明顯,通常一個(gè)愈傷上的叢生芽只分化一個(gè)不定芽(見(jiàn)圖5.F)。以先長(zhǎng)芽,后長(zhǎng)根的方式開(kāi)始發(fā)育。三周左右能觀察到愈傷已增長(zhǎng)至2～3 cm,且無(wú)菌苗快長(zhǎng)至三角瓶口,一個(gè)月后大約可長(zhǎng)至20 cm左右,同時(shí)根系發(fā)達(dá),即可煉苗后移栽,植株生長(zhǎng)良好。(見(jiàn)圖5.G)。其間只有少數(shù)分化植株未長(zhǎng)出根,同時(shí)少量愈傷有褐化現(xiàn)象,只需將未分化出根的小苗轉(zhuǎn)入無(wú)任何激素的培養(yǎng)基中即可生根。由圖5可知,在12～14號(hào)分化培養(yǎng)基中,分化率差異不顯著,在13號(hào)培養(yǎng)基中達(dá)到最高,為38.88%。

圖4 不同分化培養(yǎng)基對(duì)愈傷分化的影響Fig.4 Effect of differention under different media

3 討論與結(jié)論

本研究首次以白羊草7日齡的真葉為外植體,誘導(dǎo)出大量愈傷組織。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),愈傷組織基本都發(fā)生在真葉靠近下胚軸端的切口,這與倪德祥用甜葉菊的莖段培養(yǎng)所發(fā)現(xiàn)的規(guī)律相一致[7]。這就是我們?cè)谏飳W(xué)上所說(shuō)的器官發(fā)生全息規(guī)律。試驗(yàn)表明,白羊草下胚軸端在離體培養(yǎng)時(shí)其器官發(fā)生的部位及數(shù)量、頻率的梯度變化都遵循生物全息規(guī)律。因此,用白羊草真葉切段進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí),選用其形態(tài)學(xué)下端切段較好。這與郝建國(guó)在小麥葉基誘導(dǎo)愈傷中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致[8]。

愈傷組織的誘導(dǎo)和分化是組織培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,我們主要靠包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的使用及不同的使用比例來(lái)調(diào)節(jié),它們的不同組合及含量直接影響到對(duì)培養(yǎng)物的培養(yǎng)。Zhang等[9]和田文忠[10]指出,禾本科植物愈傷組織誘導(dǎo),2,4-D通常是起決定作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。施加外源2,4-D可以促進(jìn)植物細(xì)胞生長(zhǎng)素含量提高,從而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的發(fā)生。ABA在禾本科植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)中的作用越來(lái)越引起人們的注意。Bhasharan等[11]和張棟等[12]在研究中提到了ABA促進(jìn)禾本科胚性愈傷的誘導(dǎo)。米慶莉等[13]指出,ABA的存在可以抑制胚芽和胚根的生長(zhǎng),有利于愈傷吸塵,同時(shí),也增加了愈傷致密度和顆粒狀的程度,提高了愈傷的質(zhì)量。本試驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn),ABA的誘導(dǎo)效果遠(yuǎn)不及KT,差異極顯著。說(shuō)明對(duì)于白羊草真葉來(lái)說(shuō),KT的誘導(dǎo)作用優(yōu)于ABA。

圖5 白羊草植株再生過(guò)程Fig.5 The course of plant regeneration in Bothriochloa ischaemum

真葉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率相對(duì)較高,尤其是在繼代后,使愈傷組織狀態(tài)有了明顯的改善,結(jié)構(gòu)變得致密,顏色更加鮮艷,表面更為干燥,說(shuō)明繼代有助于胚性愈傷組織的形成。但將其接種分化培養(yǎng)基后,隨著接種時(shí)間延長(zhǎng),一個(gè)月后愈傷質(zhì)量下降,由以前鮮黃、顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛尹S色、表面潮濕、松散無(wú)結(jié)構(gòu)的愈傷組織,加之通常一個(gè)愈傷上的叢生芽只分化一個(gè)不定芽,致使分化率下降。所以分化階段激素的選擇及組合有待進(jìn)一步研究。

和以前的實(shí)驗(yàn)相比,在相同的分化培養(yǎng)基上,成熟種子分化率很高,說(shuō)明相同種類的激素配比對(duì)同一植物的不同器官組織培養(yǎng)有不同的效果,也就是同一材料的不同外植體在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí),其再生能力也存在差異。

在白羊草植株再生體系的建立過(guò)程中,無(wú)菌苗移栽入土是一個(gè)重要過(guò)程,由于生活環(huán)境的改變,勢(shì)必會(huì)造成生理功能上的紊亂而導(dǎo)致因此死亡。因此定植前的煉苗非常重要,通過(guò)逐步降低空氣濕度,延長(zhǎng)通風(fēng)時(shí)間以提高其抗逆性,才可得到較高的成活率。

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Callus Induction and Plant Regeneration from Hypocotyls ofBothriochloa ischaemum

YU Na1,DONG Kuan-hu2
(1.Department of Landscape;Shanxi Forestry Vocational Technical college;Taiyuan Shanxi 030009;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

An initiatory efficient protocolin vitroplant regeneration from 7d old hypocotyls ofBothriochloa ischaemumwith various hormone combinations on callus induced and plant regeneration.The results showed that the callus induced KT is marked,and KT mixture with 2,4-D is better than ABA and 2,4-D,and 2,4-D only.The frequency of callus induction reached 93.45%in the callus induction medium supplemented with 1.0 mg?L-12,4-D and NAA 0.5 mg? L-1.When the callus was transfered to the medium containing 6-BA0.1 mg?L-1and NAA0.04-0.06 mg?L-1the shoots differentiated.

Bothriochloa ischaemum;Hypocotyls;Embryogenic callus;Plant regeneration

S336

A

1671-8151(2010)01-0061-04

2009-11-20

2009-12-10

于娜(1979-),女(漢),山西陽(yáng)城人,碩士,主要從事草地資源與草地管理等方面的研究。

董寬虎,教授,博士生導(dǎo)師。Tel:0354- 6287552;E-mail:dongkuanhu@126.com

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD56B01)

(編輯:楊忠義)