銀杏葉總黃酮提取工藝的正交設(shè)計(jì)研究

李寧,李楚

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西 太原030001;2.山西省中醫(yī)藥研究所,山西 太原030001)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的葉片,主要化學(xué)成分為黃酮類、萜類,其中總黃酮含量最高[1～3]。天然來源的生物黃酮分子量小,能被人體迅速吸收,能通過血腦屏障,進(jìn)入脂肪組織,進(jìn)而體現(xiàn)消除疲勞、保護(hù)血管、防止動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器的功能。試驗(yàn)通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[4～6],最終采用乙醇水溶液作為溶劑,通過正交設(shè)計(jì)方法,考察總黃酮在提取物中的含量,以確定銀杏葉的最佳乙醇回流提取工藝。

1 材料與儀器

銀杏葉采自太原兒童公園,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定所,批號:0080-9705),亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、正丁醇(無水)、乙醇(分析純)。

主要儀器:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA,電子天平,UV-760CRT雙光束分光光度計(jì),恒溫水浴槽,電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)因素及方案

參考前人研究結(jié)果[7],確定影響總黃酮提取效率的考察因素有4個(gè),分別為:溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取次數(shù)(C)、提取時(shí)間(D),正交實(shí)驗(yàn)考察因素見表1?？紤]各種影響因素,選擇了L9(34)的正交試驗(yàn)方案[8]。

2.2 供試品溶液的制備

將采摘的銀杏葉片放入60～70℃的干燥箱中烘干24 h,粉碎后過40目篩,取15.6 g銀杏葉粉末置于提取容器內(nèi),加不同濃度乙醇適量回流提取,過濾。殘?jiān)偌硬煌瑵舛纫掖歼m量回流提取,過濾。殘?jiān)么家合礈鞌?shù)次,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,用乙醇定容。用UV-760CRT雙光束分光光度計(jì)在510 nm處進(jìn)行測定[9～11],以60%乙醇作參比液,采用硝酸鋁比色法[12～14],測定總黃酮的含量。

表1 正交實(shí)驗(yàn)考察因素Table 1 Levels oforthogonal experiment

總黃酮含量(%)=供試品吸光度×標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)蘆丁量/標(biāo)準(zhǔn)品吸光度×供試品量

2.3 對照溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品20 mg,置于10 mL的容量瓶中,加入60%的乙醇溶液6 mL,微熱使其溶解,再用60%的乙醇定容至刻度,搖勻,得濃度為2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)貯備液[15～17]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照溶液 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL 分別置于編號 1、2、3、4、5、6號的 10 mL具塞刻度試管中,先加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,再放置5 min,加4%氫氧化鈉溶液4 mL,各加60%乙醇定容至10 mL,放置15～20 min,在波長510 nm處測定各試管中溶液的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得回歸方程:A=8.0643c+0.0339(r=0.9920,n=6)。在0.05～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取同一濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL,置于10 mL量瓶中,在 510 nm波長處連續(xù)6次,測定吸光度,測得精密度RSD=0.28%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度的供試品溶液,每隔4 h測定一次,結(jié)果 6次測定的吸收值基本不變,RSD=0.32%,表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取2.2中的供試品溶液10 mL,分別取6份,準(zhǔn)確加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 mg,按供試品提取測定方法,計(jì)算回收率,得平均回收率=96.76%,RSD=1.09%(n=6)。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)結(jié)果分析

按照正交試驗(yàn)方案對總黃酮提取條件進(jìn)行了研究,結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析L9(34)Table 2 Orthogonal design and analysis of results L9(34)

由表2可看出,K1、K2、K3表示各個(gè)因素分別取3個(gè)水平時(shí)相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和;k1、k2、k3為K1 、K2 、K3的算術(shù)平均值;極差 R是k1、k2、k3中最大值與最小值之差,它反映了試驗(yàn)中各因素影響的大小。它們的大小順序反映出相關(guān)因素分別取三個(gè)水平時(shí)提取率的高低。

3.2 試驗(yàn)因子影響的比較分析

為了比較正交實(shí)驗(yàn)中4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,確定哪些或哪個(gè)參考因素對實(shí)驗(yàn)提取結(jié)果的影響是最顯著的或比較顯著的,從而尋找出最佳實(shí)驗(yàn)操作條件,進(jìn)行了方差分析,結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis oforthogonal experiment

由表3方差分析可知,各因素影響的順序?yàn)?A＞C＞B＞D,即乙醇的濃度對提取率的影響最大,提取時(shí)間影響最小。A2B2C2D1的組合最佳,即稱取15.6 g銀杏葉粉末加60%乙醇,料液比為1∶8,提取2次,每次1h為提取的最佳條件。

3.3 試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性驗(yàn)證

將采摘的銀杏葉片放入60～70℃的干燥箱中24 h,粉碎后過40目篩,置于提取容器內(nèi),按已確定的最佳提取工藝,過濾,重復(fù)一次。殘?jiān)么家合礈鞌?shù)次,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,乙醇定容。重復(fù)試驗(yàn)3次,數(shù)據(jù)見表4。

表4 銀杏葉總黃酮最佳提取工藝的驗(yàn)證Table 4 Best extraction technique of FG

表4結(jié)果表明:驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相近,確定該提取工藝基本穩(wěn)定、可行。

4 討論

以銀杏葉總黃酮提取液在510 nm波長處的吸光度為參考指標(biāo),通過總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)研究,確定了從銀杏葉中提取總黃酮的最佳條件為:以60%乙醇為溶劑,料液比為1∶8,提取2次,每次1 h,提取處理銀杏葉15.6 g。通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),確定總黃酮至少在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。該提取方法操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。為進(jìn)一步研究銀杏葉中總黃酮提取工藝提供理論依據(jù)。銀杏葉含有豐富的黃酮[18～20],具有廣泛開發(fā)和利用價(jià)值,值得綜合利用,應(yīng)該加強(qiáng)其資源開發(fā)。

[1]中華人民共和國2005版藥典(第二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:68-69.

[2]朱平華.銀杏葉黃酮類化合物的提取工藝研究[J].化工生產(chǎn)與技術(shù),2006,13(6):25-27.

[3]張喜梅,李琳,陳玲,等.葛根總黃酮提取工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008(1):42-45.

[4]韓桂榮,劉秀英.銀杏葉總黃酮提取研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,4(2):23-25.

[5]張曉丹,馬靈芝,邵碧霞.銀杏葉總黃酮的研究進(jìn)展[J].中國心血管雜志,2006,10(11):335-338.

[6]姚新生.天然藥物化學(xué)(4版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:184-188.

[7]黃河勝,馬傳庚.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2000,25(10):11-14.

[8]陳紅斗,孫黎清,董自波.銀杏葉總黃酮苷和萜內(nèi)酯類化合物最佳提取工藝研究[J].制劑技術(shù),2007(3):47-48.

[9]雷天塹,高林.銀杏提取工藝研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2002,ll(1):536-538.

[10]姜國芳,謝宗波.銀杏葉黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2004,15(5):306-308.

[11]王曉梅,曹穩(wěn)根.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].宿州學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(1):105-107.

[12]沙懷,陳桂先.銀杏葉中總黃酮的提取與測定[J].中國藥房,1995,6(5):13-14.

[13]黃鎖義,羅燕,張妍萱,等.生姜總黃酮的提取及鑒別[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(5):779-780.

[14]江德安.葉用銀杏的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技,2003,28(4):45-47.

[15]韓振明,葛梅,王建學(xué).銀杏葉提取工藝研究[J].山東醫(yī)藥工業(yè),2002,21(4):6-7.

[16]陳禮明,劉圣,唐麗琴,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選黃連散中葛根等成分的提取工藝[J].中國藥房,2006,17(6):415-417.

[17]張志紅,黃毅.銀杏葉提取物中黃酮類化合物的分光光度分析研究[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2005,24(6):17-19.

[18]李國麗,李春霞,王威強(qiáng).銀杏葉黃酮類化合物提取分離研究現(xiàn)狀和展望[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2005(5):18-23.

[19]曾立,尹文清,王安偉,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選定心藤中總黃酮提取與純化工藝[J].中國藥房,2008,19(6):418-420.

[20]曹緯國,劉志勤,邵云,等.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(12):2241-2247.