中藥復(fù)合多糖體內(nèi)外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)研究*

曹志然，王 潔，王 蓓，戎瑞雪，唐志遠(yuǎn)，王 海

(河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

近年來，中藥多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用日益受到人們的關(guān)注。從中藥中提取的活性多糖，其抗腫瘤活性主要是通過其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的[1]，多無毒，對(duì)正常細(xì)胞沒有殺傷作用，可以克服化療、放療過程中對(duì)正常細(xì)胞的損傷[2]，成為近幾年抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一。國內(nèi)已對(duì)多種多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究，但多數(shù)研究大都限于某種中藥多糖成分，或僅僅是2種多糖簡單的組合，如當(dāng)歸多糖、黃芪多糖、柘樹根多糖、甘草多糖，對(duì)從中藥方劑中提取的復(fù)合多糖抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的研究還比較少。中藥多系按照中醫(yī)理論組方用藥，復(fù)方是中藥的精髓，最能體現(xiàn)中醫(yī)用藥特色?，F(xiàn)有研究表明，多糖復(fù)合作用時(shí)，效果比單味多糖更佳，具有顯著的抗腫瘤、提高免疫功能的作用，且其之間的藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性[3]。本研究依據(jù)中藥復(fù)方的理念，從經(jīng)典的補(bǔ)血益氣方劑十全大補(bǔ)湯中提取復(fù)合多糖，通過建立荷瘤小鼠模型及體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法對(duì)復(fù)合多糖體內(nèi)外抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步探討，旨在為研制復(fù)合多糖抗腫瘤藥物及免疫輔助藥物的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及瘤株 昆明種雄性小鼠，體重20g±2.0g，40只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK(冀)2008-1-003，合格證號(hào)901027。H22(小鼠肝癌實(shí)體型瘤株)和 Hela(人宮頸癌細(xì)胞株)由河北醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.2 藥品、試劑及主要儀器 人參、白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃、黃芪、肉桂購自保定市藥材公司，經(jīng)本院馮天鑄教授鑒定均合格。RPMI-1640培養(yǎng)液干粉(美國 Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(AMRESCO公司)。刀豆蛋白 A、脂多糖均為Solarbio公司產(chǎn)品，HF90二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。倒置顯微鏡(日本Olympus)，ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國寶特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合多糖的提取 人參32g，白術(shù)32g，茯苓 32 g，甘草 16g，當(dāng)歸 48g，川芎 16 g，白芍 32g，熟地黃48g，黃芪32g，肉桂8g(共296g)，加20倍體積水回流提取 3次，分別為 1h，1h，0.5h，合并提取液，放冷后高速離心(6000r/min);將上清液減壓回收至5倍體積，加乙醇至含醇量為80%，靜置24h，高速離心(6000r/min);將上述沉淀加5倍體積水溶解，加硫酸銨至無沉淀產(chǎn)生，加0.5%活性炭脫色，加熱、抽濾后棄去沉淀;將濾液加乙醇至含醇量為80%靜置24h，高速離心(6000r/min);少量80%乙醇洗滌多次，去除多余硫酸銨，沉淀以少量水溶解，冷凍干燥，即為精多糖部分，重量為56g，多糖獲得率為18.92%。

1.2.2 H22荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下抽取接種7d，生長良好的H22荷瘤小鼠腹水(活癌細(xì)胞數(shù)>95%)，用無菌生理鹽水制成細(xì)胞數(shù)為5×106·ml－1的細(xì)胞懸液，小鼠右腋部皮下接種，0.2ml/只。

1.2.3 分組與給藥途徑 40只雄性昆明種小鼠接種腫瘤細(xì)胞24h后稱重，隨機(jī)分為5組:1組為模型對(duì)照組;2-5組為用藥組(2組為順鉑(DDP)陽性對(duì)照組;3組為順鉑+高劑量復(fù)合多糖組;4組為順鉑+中劑量復(fù)合多糖組;5組為順鉑+低劑量復(fù)合多糖組)。3組 ～5組分別用168.4mg.ml－1、84.2 mg.ml－1、42.1mg·ml－1復(fù)合多糖灌胃給藥，每天每只0.5ml，連續(xù)10 d;2組～5組腹腔注射順鉑，每天每只0.02mg，連續(xù)10d，1組用等量溫開水灌胃和生理鹽水腹腔注射。

1.2.4 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長及一般狀況的影響 末次給藥后24h將小鼠稱重，眼眶取血，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白;脫頸處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，解剖摘取瘤塊、用濾紙吸干后稱重，計(jì)算抑瘤率。同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況及進(jìn)食量。

1.2.5 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)及T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 采用 MTT法[4]。無菌摘取小鼠脾臟并稱重，制備脾細(xì)胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×106·ml－1，將細(xì)胞懸液加至96孔培養(yǎng)板中，90μl/孔，設(shè) Con A刺激組(終濃度為 5μg· ml－1)、LPS 刺激組 (終濃度為 10μg·ml－1)和無血清培養(yǎng)液對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h后加入5mg·ml－1的MTT 15ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加DMSO 150ul，震蕩5min，酶標(biāo)儀測490nm波長下的OD值，計(jì)算刺激指數(shù)。

1.2.6 復(fù)合多糖體外抑瘤作用 采用MTT比色法。Hela細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)液(含10%熱滅活胎牛血清，0.2%NaHCO3，100U·ml－1青霉素、100μg·ml－1鏈霉素、3mmol·l－1L-谷氨酰胺)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，按貼壁方法培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2 ×104·ml－1，以 90μl/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，復(fù)合多糖組分別加入終濃度為 200μg·ml－1、100μg·ml－1、50μg·ml－1、25μg· ml－1、12.5μg· ml－1的 復(fù) 合 多 糖10μl，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等量無血清1640培養(yǎng)液;置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于20h、44h、68h 取出培養(yǎng)板，每孔加 5mg·ml－1的 MTT 15μl，4h 后終止培養(yǎng)，棄上清加 DMSO 150μl，震蕩5min，酶標(biāo)儀測490 nm波長下的光密度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS16.0軟件處理，各組數(shù)據(jù)由s表示，組間兩兩比較采用方差分析中的兩兩比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合多糖對(duì)H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響

表1顯示，小鼠接種瘤細(xì)胞4d后飲食減少、皮毛無光澤，均可觸及皮下腫塊。用藥組荷瘤小鼠增重量均較模型對(duì)照組低，高、中劑量多糖組與順鉑合用組與單純順鉑組比較，小鼠體重明顯增加(P<0.05)。用藥組與模型對(duì)照組相比，瘤重均明顯減輕(P<0.05)，單獨(dú)使用順鉑抑瘤率為22%，當(dāng)順鉑和不同劑量的復(fù)合多糖聯(lián)用時(shí)，高、中劑量組抑瘤率分別增加至36%、37%。

表1 復(fù)合多糖對(duì)H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(s)

表1 復(fù)合多糖對(duì)H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(s)

注:與模型對(duì)照組比較:*P<0.05;與順鉑組比較:▲P<0.05

組抑瘤率模型對(duì)照組別 例 數(shù) 體重變化(g)瘤重(g)DDP 8 3.02±1.93* 1.05±0.21* 22%DDP + PSC(168.4mg·ml－1) 8 3.93±1.74*▲ 0.87±0.28*▲ 36%DDP +PSC(84.2 mg·ml－1)8 3.49±0.99*▲ 0.85±0.25*▲ 37%DDP+PSC(42.1 mg·ml－1)8 2.98±1.21*1.05±0.27 22%

2.2 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠 WBC、RBC、HGB數(shù)及脾指數(shù)的影響

表2顯示，與模型對(duì)照組相比，順鉑組小鼠白細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，復(fù)合多糖組沒有顯著性差異;與順鉑組相比，不同劑量復(fù)合多糖組白細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，中劑量復(fù)合多糖組紅細(xì)胞、血紅蛋白數(shù)增加明顯。順鉑組的脾指數(shù)顯著低于模型對(duì)照組(P<0.01)，復(fù)合多糖+順鉑組脾指數(shù)顯著高于順鉑組(P<0.05)，且隨復(fù)合多糖藥物濃度的增大而增大。

表2 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠WBC、RBC、HGB數(shù)及脾指數(shù)的影響(s)

表2 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠WBC、RBC、HGB數(shù)及脾指數(shù)的影響(s)

注:與模型對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01;與順鉑組比較:▲P<0.05

組別 例數(shù) WBC(109·L－1)RBC(1012·L－1)HGB(g·L－1)脾指數(shù)(mg·g－1)6.87±0.68 7.94±0.79 112.2±13.5 7.18±1.34 DDP 8 5.11±0.92* 7.95±0.98 123.8±18.0 3.59±0.68**DDP + PSC(168.4mg·ml－1)8 7.12±0.53▲ 8.01±0.45 131± 6.4 5.73 ±0.56*▲DDP + PSC(84.2 mg·ml－1)8 6.61±0.34▲ 9.06±0.55▲ 139± 6.4▲ 4.67±0.89*▲DDP + PSC(42.1 mg·ml－1)8 6.18±1.12▲ 8.18±1.11 120.6± 9.6 3.48±0.88模型對(duì)照組8*

2.3 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

表3 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(s)

表3 復(fù)合多糖對(duì)荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(s)

注:與模型對(duì)照組比較:*P<0.05，*P<0.01;與順鉑組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

模型對(duì)照組DDP 8 1.35±0.158* 1.39±0.20*DDP +PSC(168.4mg·ml－1) 8 2.44 ±0.66**▲▲ 2.07 ±0.41**▲▲DDP+PSC(84.2 mg·ml－1)8 1.94 ±0.329**▲▲ 1.68 ±0.47*▲DDP+PSC(42.1 mg·ml－1)8 1.567 ±0.23*▲1.36±0.27

表3顯示，與模型對(duì)照組比較，高中劑量復(fù)合多糖治療后荷瘤小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著高于模型對(duì)照組(P<0.01)，而順鉑治療后轉(zhuǎn)化能力明顯降低(P<0.05);與順鉑組比較，順鉑和不同濃度的復(fù)合多糖聯(lián)用可顯著增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力(P<0.05或 P<0.01)。

2.4 復(fù)合多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

表4顯示，同一作用時(shí)間下，細(xì)胞增殖抑制率隨復(fù)合多糖濃度的增加而顯著提高;相同復(fù)合多糖濃度下，隨作用時(shí)間的延長，抑制率有明顯增大趨勢。

3 討論

惡性腫瘤目前以手術(shù)、放療、化療為主，手術(shù)多適用于早期癌癥患者，放療、化療只對(duì)敏感瘤株有效，且會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)和后遺癥，同時(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往伴有機(jī)體免疫功能的降低。近年來，國內(nèi)外學(xué)者證實(shí)多糖不僅是一種良好的抗腫瘤物質(zhì)，而且其促進(jìn)和恢復(fù)機(jī)體免疫功能的作用較為突出，因此中藥活性多糖的抗癌作用受到越來越多的重視。

表4 復(fù)合多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用(s)

表4 復(fù)合多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用(s)

注:與對(duì)照組比較:*P<0.01

組別24h 48h 72h OD IR(%)OD IR(%)OD IR(%)對(duì)照組46.3 0.72±0.01 0.82±0.01 0.90±0.01 1 0 0 μg · ml－1 0.46±0.01* 31.6 0.42±0.02* 43.4 0.38±0.01* 55.2

本研究中的復(fù)合多糖從經(jīng)典的補(bǔ)血益氣方劑-十全大補(bǔ)湯中提取，其組成成分黃芪、當(dāng)歸、甘草等均具有確切的抗腫瘤活性。根據(jù)中藥復(fù)方配伍的理念，復(fù)合多糖提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)合多糖進(jìn)行了體內(nèi)外抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能的研究，復(fù)合多糖體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)Hela細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且呈時(shí)間-劑量依賴性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合多糖與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同抗小鼠H22肝癌的作用，在荷瘤小鼠用藥10d后，與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合復(fù)合多糖3個(gè)劑量組均能顯著提升脾指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)，拮抗順鉑引起的免疫抑制作用。同時(shí)復(fù)合多糖可使ConA和LPS激發(fā)的T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)，表明復(fù)合多糖對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞的功能具有增強(qiáng)作用，可以通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫功能而發(fā)揮一定的抗腫瘤效應(yīng)。觀察各組小鼠還發(fā)現(xiàn)，復(fù)合多糖組小鼠一般狀態(tài)良好，外觀、毛色、大便、活動(dòng)、體重增長等均較順鉑組明顯改善，說明復(fù)合多糖可拮抗順鉑的毒副作用。

綜上所述，中藥復(fù)合多糖體內(nèi)外均顯示明顯的抗腫瘤活性，與順鉑聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，具有良好的應(yīng)用前景。

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