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    非水反相色譜法測定球蟲感染后三黃雞血清中類胡蘿卜素的含量

    2010-06-07 10:32:48王德圣李永勝
    飼料工業(yè) 2010年4期
    關(guān)鍵詞:中類球蟲胡蘿卜素

    王德圣 李永勝 趙 劍

    自然界中已發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素有600種,都可以看作是從β-胡蘿卜素衍生而來的。但只有很少一部分類胡蘿卜素能有效的沉積在禽體內(nèi)。

    類胡蘿卜素從吸收入血液到沉積到相關(guān)部位受到很多因素的影響,其中疾病的感染最為嚴(yán)重。Ruff等(1974)報道了雞在常見的6種球蟲感染后,血清中類胡蘿卜素含量在感染后的6~8 d都明顯下降;Koutsos等(2003)報道了注射LPS或IL-1引起的血漿中類胡蘿卜素含量發(fā)生變化。血液類胡蘿卜素含量對疾病感染的敏感性引起了研究者的興趣,而準(zhǔn)確測定血液中類胡蘿卜素含量的方法還有待完善。另外,測定血液中類胡蘿卜素含量有利于真實(shí)準(zhǔn)確地反映其生物學(xué)利用率,從而取代依靠飼料類胡蘿卜素含量與產(chǎn)品色澤相關(guān)關(guān)系這一粗放的評價指標(biāo)。

    高效液相色譜法是近10年來應(yīng)用最普遍的定性、定量檢測血液中類胡蘿卜素含量的方法。Waysek提出了以正相色譜法分離類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn),但是柱填料硅膠會促進(jìn)類胡蘿卜素的分解。采用常規(guī)反相色譜由于流動相中含有一定量水,導(dǎo)致洗脫類胡蘿卜素這類非極性組分的峰型不對稱,甚至還會發(fā)生組分的柱上沉淀。非水反相色譜法被認(rèn)為是當(dāng)前測定生物組織類胡蘿卜素含量最好的方法(Su等,2002;Furr,2004),但這類研究以人血液為樣本,分離的結(jié)果中沒有出現(xiàn)對角黃素(Canthaxanthin)和Apo類胡蘿卜素酯(Apo-Carotenioc ester)的特征描述,而這恰是家禽飼料中應(yīng)用最多的兩種色素成分。

    本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,建立了一種非水反相液相高效色譜測定血液中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的分析方法,并比較了在堆型或柔嫩艾美爾球蟲感染下血清中這兩種物質(zhì)的變化。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要設(shè)備和試劑

    Waters2690高效液相色譜儀,Nova-Pak C18色譜柱(300 mm×3.9 mm ID,5 μm),UV-100紫外可見光檢測器,Sigma-2K15型低溫高速離心機(jī),IKA-MS1型旋渦混勻機(jī),KQ-250B型超聲波清洗機(jī)。

    甲醇、乙腈和四氫呋喃均為色譜純,無水乙醇、正己烷和抗壞血酸為分析純。角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司,純度96%。

    分別精確稱取0.0040 g的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇:乙腈:四氫呋喃為75:20:5混合液定容到 100 ml制成儲備液(40 μg/ml),再分別稀釋制成 2、4、6、8、10 μg/ml用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。

    1.2 樣品的采集和制備

    1.2.1 樣品采集

    144只三黃雞平均分成A、B、C 3組。飼料按NRC家禽營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制,角黃素和Apo類胡蘿卜素酯在 0~21、22~29、30~42 日齡的飼料中添加量分別是30、35、19.5 mg/kg 和 15、25、14 mg/kg。在第 21 日齡時,B組每羽嗉囊接種3×104個堆型艾美爾球蟲孢子化卵囊;C組每羽嗉囊接種1.5×104個柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊;A組作為對照組。分別在感染后的第0、7、14 d每組選6只雞各抽取2 ml血液,自然凝固后在4℃下5000 r/min離心15 min,收集血清,保存在-30℃冰箱備用。

    1.2.2 樣品制備

    用移液槍精確吸取100 μl血清樣品置于5 ml聚乙烯離心管中,加入100 μl無水乙醇后振蕩,再加入1 ml正己烷,2000 r/min旋渦混勻1.5 min,然后在4℃下15000 r/min離心3 min后用移液槍收集上清液。將離心管中的沉淀破碎后再加入1 ml正己烷,超聲水浴3 min后取出,重復(fù)上述旋渦混勻和離心過程。將兩次的上清液合并后加入0.5 ml雙蒸水,重復(fù)上述旋渦混勻和離心過程,之后用移液槍精確吸取0.5 ml正己烷相置1 ml聚乙烯離心管中,氮?dú)獯蹈珊笥?00 μl流動相溶解。制成的樣品密封后放置于-30℃冰箱中避光保存,8 h內(nèi)過色譜儀測定。

    1.3 色譜條件

    流動相為甲醇:乙腈:四氫呋喃按照75:20:5(v: v: v)配制,然后加 0.05%(w: v)抗壞血酸。流速為1.0 ml/min,檢測器檢測波長450 nm,壓力30 bar,柱溫 20 ℃,進(jìn)樣量 20 μl。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    分別取2種類胡蘿卜素各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液20 μl依次進(jìn)樣。記錄出峰時間和出峰面積,計算每種物質(zhì)的平均出峰時間,用外標(biāo)峰面積法測定線性關(guān)系。

    角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖見圖1。

    圖1 黃體素、角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

    在本實(shí)驗(yàn)條件下,角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的保留時間分別是:(4.69±0.04)min 和(5.72±0.10)min(n=5)。

    以各類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),相應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)繪制2條標(biāo)準(zhǔn)曲線:角黃素,Y=5×10-6X-0.3169(R2=0.9924);Apo 類胡蘿卜素酯,Y=3×10-6X-0.2325(R2=0.9991)。

    2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

    采用加標(biāo)回收法。取同一樣品0.7 ml均分成7份,其中6份加入已知量的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),另1份作為對照。按1.2節(jié)中樣品制備方法進(jìn)行處理,色譜測定的結(jié)果見表1。

    2.3 樣品色譜分離情況(見圖2)

    表1 方法回收率(n=6)

    圖2 血清樣品中類胡蘿卜素的色譜圖

    圖2為血清樣品中類胡蘿卜素的色譜圖。在本實(shí)驗(yàn)選定的分離條件下,雞血清樣品可分離出4種物質(zhì)。對照圖1可見,血清樣品中的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯有著各自明顯的特征峰,得到了很好的分離。血清樣品中最早分離出的物質(zhì)(t保留=4.07±0.01)與黃體素(Lutein)在本實(shí)驗(yàn)條件的保留時間一致(見圖1)。

    2.4 不同球蟲感染后血清中類胡蘿卜素的變化

    采用本實(shí)驗(yàn)方法測定雞球蟲感染后第0、7和14 d血清中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的含量,結(jié)果見表2和圖3。從表2、圖3可見,當(dāng)飼料中添加量減少,血清中該類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化。球蟲感染后,血清中的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯水平都出現(xiàn)了顯著的下降趨勢,但出現(xiàn)的時間在不同球蟲感染中相差很大。

    表2 不同球蟲感染后不同時間血清角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的含量(μg/ml)

    圖3 球蟲感染后2周雞血清中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯含量變化曲線

    3 分析和討論

    3.1 實(shí)驗(yàn)方法評估

    3.1.1 方法學(xué)對回收率的要求在95%~105%,但有些方法操作步驟繁復(fù),可要求在90%~110%。而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),一般要求應(yīng)根據(jù)樣品含量高低和含量測定方法的繁簡確定,如含量很低一般不大于5%;含量較高的,則應(yīng)從嚴(yán)要求。

    本實(shí)驗(yàn)建立的測定方法對角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的回收率分別是99.7%和102.0%,RSD分別為5.25%和4.28%,符合方法學(xué)的要求。

    3.1.2 雞血清樣品在本實(shí)驗(yàn)中分離出4種物質(zhì),其中1、3和4號物質(zhì)通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比較可以確定依次是黃體素、角黃素和Apo類胡蘿卜素酯。Barua(1992)使用與本實(shí)驗(yàn)相近的方法在人血清中也分離出1號和2號物質(zhì),并認(rèn)為2號物質(zhì)為玉米黃質(zhì)(Zeaxanthin)。黃體素和玉米黃質(zhì)都是玉米、玉米蛋白粉中主要的類胡蘿卜素,二者是位置異構(gòu)體(見圖4)。色譜分析結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)條件下還不能很好的分離這樣的異構(gòu)物質(zhì)。

    圖4 黃體素(Lutein)和玉米黃質(zhì)(Zeaxanthin)的結(jié)構(gòu)式

    3.2 球蟲感染的影響

    不同種的球蟲感染對血清中類胡蘿卜素含量變化的影響并不一致。堆型艾美爾球蟲感染后血清類胡蘿卜素變化的規(guī)律與Ruff等(1974)的報道一致。而柔嫩艾美爾球蟲降低血清中類胡蘿卜素含量出現(xiàn)在感染的7 d之后并影響到感染后的第14 d,這是以往研究中所未曾提及的。引起這一現(xiàn)象的原因尚不清楚,可能與本實(shí)驗(yàn)感染球蟲卵的數(shù)目較低有關(guān)。

    [1]Barua A B,Harold,C.Furr,et al.Simultaneous analysis of individual carotenoids,retinol,retinyl esters,and tocopherols in serum by isocratic non-aqieous reversed-phase HPLC[J].Food Chemistry,1992,46:419-424.

    [2]Harold C.Furr.Analysis of retinoids and carotenoids:problems resolved and unsolved[J].TheJournal of Nutrition,2004,134:281s-285s.

    [3]Koutsos A.Elizabeth,C.Christopher,et al.The effect of an acute phase response on tissue carotenoid levels of growing chickens(Gallusgallusdomesticus)[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A,2003,135:635-646.

    [4]Ruff M D,W.M.Reid,J.K.Johnson.Lowered blood carotenoid levels in chickens infected with coccidia[J].Poultry Science,1974,53:1801-1809.

    [5]Su Qing,Kevin G.Rowley,Nicholas,et al.Carotenoids:separation methods applicable to biological samples[J].Journal of Chromatography B,2002,781:393-418.

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