酶解法提取腸膜肽工藝條件的優(yōu)化

徐建超 章世元 全麗萍 謝月華 韓莉娜 侯文博

中國是生豬資源大國，產(chǎn)品肝素鈉原料資源豐富，是世界上肝素鈉主要出口國之一。目前我國主要以豬小腸粘膜為原料，提取的肝素鈉（任紅媛等，2007）抗凝活性高，在國際市場上頗受歡迎。肝素在組織內(nèi)和其它粘多糖一起以共價鍵的形式與蛋白質結合成復合物，需進行水解使其解離下來（江燕等，2001），故該廢水是一種高鹽、高氮的高濃度有機廢水，含豐富的腸膜蛋白，目前鹽解法廠家可獲得腸膜蛋白粉，酶解法中的腸膜蛋白則隨污水排放。據(jù)侍愛秋（2002）的報道推算，我國肝素加工廢水年排放量約64.2萬噸，粗略估計含粗蛋白量高達4 333.5 t，數(shù)量可觀。目前，許多企業(yè)以優(yōu)質蛋白為原料，應用現(xiàn)代生物工程技術開發(fā)小肽系列產(chǎn)品，使其富含動物生長必需的有生命活動調(diào)節(jié)功能的生物活性肽和易吸收利用的營養(yǎng)性短肽。蛋白經(jīng)過酶解或發(fā)酵處理后具有易于吸收、低抗原等特點，并能加快機體蛋白合成，提高機體免疫力，刺激消化道發(fā)育，增進動物食欲，促進礦物元素吸收，加速脂肪代謝等功能，從而提高生長速度，改善飼料利用率，是新一代綠色、高效、安全的營養(yǎng)性飼料添加劑。本試驗利用各種蛋白酶水解肝素加工廢水中的腸膜肽，確定最佳酶解條件，以期為該廢水金屬蛋白肽鹽合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

肝素加工廢水是鹽解法提取肝素鈉工藝廢水，撈取腸膜蛋白后其主要成分分析見表1。

表1 肝素加工廢水主要成分分析

1.1.2 試劑

水解蛋白酶：活力2.4 AU-A/g；風味蛋白酶：活力1 000 LAPU/g；復合蛋白酶：活力1.5AU-NH/g。3種酶及酶活均來自諾維信（中國）生物技術有限公司。

1.1.3 儀器設備

pHB-5酸度計（上海偉業(yè)儀器廠生產(chǎn)）、4℃冷凍離心機（上海浦東天本離心機械有限公司生產(chǎn)）、SHT型精密數(shù)顯磁力攪拌電熱套（山東省菏澤市祥龍電子科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解工藝（陸利霞等，2008）

量取一定量肝素廢水，用磷酸鹽緩沖液調(diào)至不同pH值，準確加入不同量的各種酶（注：相對于底物粗蛋白含量，下同），在不同溫度下，反應一定時間用酶解液滅酶（100℃，3 min），然后5 000 r/min離心 15 min，取上清液備用測定水解度。

1.2.2 總氮的測定

采用凱氏定氮法GB11891——89。

1.2.3 氨基氮的測定（郭艷，2008；陳貴堂等，2008）

采用甲醛滴定法GB/T5009.39——2003。

1.2.4 水解度的計算（張全才，2007；陳杰等，2007）

水解度(%)=(氨態(tài)氮/總氮)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

Excel建立數(shù)據(jù)庫,SPSS17.0統(tǒng)計軟件的ANOVA法進行方差分析,S-N-K法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 水解酶的確定

從肝素加工廢水中提取易被動物吸收的腸膜肽，首先要確定水解酶。催化蛋白質水解的酶種類很多，主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。內(nèi)肽酶將蛋白質分子內(nèi)部切斷形成多肽。外肽酶從蛋白質分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸。工業(yè)生產(chǎn)上應用的蛋白酶主要是內(nèi)肽酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等。水解蛋白時，內(nèi)肽酶和外肽酶復合作用才能得到高水解度的復合氨基酸液。外肽酶還能賦予產(chǎn)生的肽和氨基酸更多的香味和更飽滿的風味。

本試驗采用水解蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶及水解-風味復合酶。其中風味蛋白酶是外切酶，水解蛋白酶是內(nèi)切酶，復合蛋白酶由內(nèi)切酶和外切酶復合。根據(jù)各酶適用的水解條件為：pH值7，溫度50 ℃，總酶量 2%，測定時間 1、2、3、4、5 h。采取 3 個平行試驗，對時間因素選取5個水平，考察4種蛋白酶水解肝素廢水測得的水解度，結果見表2。

表2 各種蛋白酶水解肝素廢水測得水解度（%）

由表2可知,以肝素加工廢水為底物，相比之下用風味-水解2：1復合酶水解效果最好。3 h時蛋白水解度最高,為7.49%。所以選擇風味-水解復合酶做進一步研究。

2.2 風味-水解復合酶水解條件的初步確定

影響蛋白酶水解效果的因素有很多，如水解溫度、pH值、水解時間、料液比、加酶量等。利用單因素試驗法設計5組試驗，分別考察風味-水解復合酶水解的最佳作用條件范圍，對該酶水解條件進行初步確定。

2.2.1 最適反應時間的確定

采取3個平行試驗，pH值為7.0，溫度50℃，加酶量2.0%，風味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，時間分別調(diào)至 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h，試驗結果如圖1 所示。

一般來說，同樣的加酶量，水解時間越長水解度越高，到了一定的時間后上升趨勢會減慢。由圖1可見，反應時間對水解度影響較明顯。在前5 h里隨著反應時間的增加，蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，以3 h時水解度最大。5 h后隨著反應時間的延長，水解度逐漸上升?？赡苁莾煞N酶對該底物的最佳水解時間差距較大?？紤]能耗因素，故確定最適反應時間為3 h進行后續(xù)試驗。

2.2.2 最適總酶量的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0、溫度50℃、反應時間為3 h、風味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，改變反應體系中的酶添加量（1%、2%、3%、4%），考察酶添加量與腸膜蛋白提取率的關系，試驗結果如圖2所示。

由圖2可知，當風味蛋白酶與水解蛋白酶以2：1比例復合時，總濃度在2%其水解度最大，所以確定兩種酶總濃度最適為2%。

2.2.3 風味蛋白酶與水解蛋白酶最適比的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0，溫度50℃，反應時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例分別為 1： 1、2： 1、3： 1、4： 1，試驗結果如圖3所示。

由圖3可知，酶總量為2%時水解度隨風味蛋白酶與水解蛋白酶復合比例的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，兩酶以2：1復合時腸膜蛋白水解度最大，但總體上兩酶的比例對蛋白水解度影響不大。故確定風味蛋白酶與水解蛋白酶最適比為2：1。

2.2.4 最適酶解溫度的確定

采取3個平行試驗，水解pH值為7.0，反應時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度分別設為40、50、60、70℃，試驗結果如圖4所示。

酶對溫度也比較敏感，有其最適的反應溫度范圍。由圖4可知，隨著溫度的增加，水解度總體呈上升趨勢，40℃至50℃上升較明顯，50℃之后比較平緩，考慮經(jīng)濟因素，確定最適反應溫度為50℃。

2.2.5 最適pH值的確定

采取3個平行試驗，反應時間為3 h，加酶總量為2%，風味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度為50 ℃，pH 值設為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，試驗中每隔半小時對pH值進行一次調(diào)節(jié),試驗結果如圖5所示。

酶作為一種具有生物活性的蛋白質，環(huán)境pH值會影響酶分子的構象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應速度。由圖5可知，pH值對該酶水解效果影響較明顯。隨著pH值的增加，水解度呈下降的趨勢，在pH值為4.0到7.0之間較平緩，而7.0之后下降幅度較大。所以選擇pH值為4.0、5.0、6.0 進行正交試驗。

2.3 風味-水解復合酶酶解正交試驗

依據(jù)單因素試驗初步確定的酶解條件，選擇pH值，酶總濃度，風味、水解蛋白酶比例，反應時間，反應溫度作為試驗因素，以水解度為指標，采用L16（35）正交試驗設計，對風味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水條件進行優(yōu)化，因素水平見表3，正交試驗設計及結果見表4。

表3 L16（35）正交試驗因素水平

表4 風味-水解蛋白酶水解肝素廢水正交試驗結果

表5 L16（35）正交試驗結果方差分析

從極差分析正交試驗的方差分析（表5）可以看出，五因素對水解度的影響程度不同，影響的主次順序也不盡相同。其中酶總濃度和風味蛋白酶與水解蛋白酶量之比對水解度影響較大。各因素影響程度由大到小順序為 C（風味、水解蛋白酶比例）＞B（酶總濃度）＞D（時間）＞A（pH 值）＞E（溫度），最佳試驗條件為 A2B3C1D1E1。根據(jù) Ki分析的最佳組合為A1B3C3D3E1，用A1B3C3D3E1組合進一步試驗，得腸膜肽水解度為16.18%。所以，風味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水最佳組合為 A2B3C1D1E1，即酶總濃度3%，風味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度50℃，pH值5.0，酶解時間2 h，此條件下的水解度為17.45%。

關于腸膜蛋白的提取，舒夏娃等（2007）選用木瓜蛋白酶對豬小腸黏膜提取肝素后的下腳料進行水解，結果表明，影響水解度的主次因素順序為：溫度＞底物濃度＞酶加量＞pH值，最佳的水解條件下的水解度為20.63%，此時底物濃度為6%。本試驗得到的蛋白水解度偏低可能是由于底物濃度較低，而且由于原料性質的限制，未對底物濃度對酶解的效果進行考察。王春維等（2005）通過胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對豬腸膜水解效果研究表明,木瓜蛋白酶優(yōu)于胰蛋白酶,影響木瓜蛋白酶水解度的主次因素順序為：時間＞溫度＞pH值，最適條件下的蛋白水解度為83.45%。可見，蛋白水解度與底物的濃度，蛋白的含量有很大關系。

3 結論

確定風味-水解蛋白酶為最適水解酶。采用單因素及正交試驗方法確定風味蛋白酶與水解蛋白酶復合酶酶解肝素廢水的最適條件，即酶總濃度3%，風味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度 50℃，pH值5.0，酶解時間2 h。在此條件下水解度為17.45%。

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