細(xì)胞固定劑對(duì)GFP發(fā)光特性影響的研究

張廣峰，陳祥貴，帥培強(qiáng)，林 琳

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川 成都 610041)

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)記蛋白，常以融合蛋白的形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，以觀察目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的移動(dòng)和定位。

在很多研究中，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定以便進(jìn)行后續(xù)的顯微觀察、探針雜交或免疫化學(xué)染色。但是細(xì)胞固定過程中，固定劑選擇不當(dāng)或者固定程序不合理可能導(dǎo)致GFP熒光強(qiáng)度顯著下降甚至熒光消失，從而不能觀察到GFP的分布、定位及相關(guān)的顯微結(jié)構(gòu)變化[1]。因此，探索不同細(xì)胞固定劑對(duì)GFP發(fā)光特性的影響，對(duì)指導(dǎo)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究具有一定的實(shí)際意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞(ATCC HB-8065TM)購于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院。HepG2細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。一般2～3 d傳代1次。

1.2 細(xì)胞固定劑

95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、丙酮、Carnoy固定液(無水乙醇60 mL+氯仿30 mL+5%冰醋酸10 mL)、4%多聚甲醛(pH值7.4)。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 GFP在細(xì)胞中的表達(dá)

貼壁培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞經(jīng)0.02%EDTA+0.25%胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，鋪于96孔板上，每孔200 μL，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 d后，用表達(dá)GFP的腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為30，48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況，當(dāng)細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到80%以上時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。以未經(jīng)腺病毒感染的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 細(xì)胞固定

將發(fā)光細(xì)胞的培養(yǎng)液吸去，并用PBS洗滌2次，然后加入待試固定劑200 μL，按室溫、4℃分別固定5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，固定后將固定液吸出，然后用 PBS洗滌3次。倒置顯微鏡(Leica DMILHC)觀察固定后發(fā)光情況并拍照。

1.5 酶標(biāo)儀測(cè)發(fā)光值

經(jīng)不同固定劑固定的96孔板上細(xì)胞用熒光/化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(TECAN F200)測(cè)發(fā)光值(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm)。對(duì)比固定前后發(fā)光值，按下式計(jì)算GFP熒光保存百分率(F)：

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光顯微鏡觀察固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響

HepG2細(xì)胞經(jīng)腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，48 h后80%以上細(xì)胞表達(dá)GFP。在感染復(fù)數(shù)為30時(shí)，細(xì)胞未見明顯病變。表達(dá)GFP的細(xì)胞用不同固定劑處理后，在顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響(室溫5 min)

由圖1可以看出，在室溫下，Carnoy固定液、甲醇、5%冰醋酸固定5 min后，細(xì)胞GFP熒光基本消失，95%乙醇固定導(dǎo)致GFP強(qiáng)度顯著降低，而丙酮和4%多聚甲醛固定30 min后仍然可觀察到足夠強(qiáng)的熒光。

2.2 酶標(biāo)儀檢測(cè)固定劑對(duì)細(xì)胞GFP發(fā)光的影響

細(xì)胞用不同固定劑進(jìn)行固定，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞發(fā)光值，結(jié)果見圖2。

圖2 室溫(a)和4℃(b)固定后細(xì)胞GFP熒光保存百分率

由圖2可以看出，無論在室溫還是4℃進(jìn)行固定，Carnoy固定液、95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸處理5 min就使得GFP發(fā)光值降低到25%及以下。而4%多聚甲醛和丙酮處理5 min對(duì)GFP發(fā)光無顯著影響；但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GFP發(fā)光值逐漸降低；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，4%多聚甲醛固定的細(xì)胞和丙酮4℃固定的細(xì)胞仍可保存大約40%的發(fā)光值。

2.3 討論

細(xì)胞和組織固定劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)不同的組織、細(xì)胞類型及不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛是生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的固定劑，冰醋酸和Carnoy固定液用于一些特定的細(xì)胞和組織切片。盡管GFP廣泛用于生物醫(yī)學(xué)的研究，但是對(duì)于組織細(xì)胞固定過程中GFP發(fā)光特性變化的研究報(bào)道很少，實(shí)驗(yàn)人員只能從相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道中收集零星的信息來作為指導(dǎo)。但遺憾的是，大多數(shù)文獻(xiàn)對(duì)細(xì)胞固定方法的描述非常簡(jiǎn)單，使經(jīng)驗(yàn)不豐富的實(shí)驗(yàn)人員難以準(zhǔn)確把握。從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來看，表達(dá)GFP的細(xì)胞的固定大多數(shù)采用多聚甲醛，能有效地保持GFP的發(fā)光特性，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。但是，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，為了保持GFP的發(fā)光特性，配制多聚甲醛時(shí)必須將其pH值保持在中性，否則會(huì)導(dǎo)致GFP熒光消失。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：丙酮是保持GFP熒光特性的另一可選的細(xì)胞固定劑。在4℃用丙酮固定30 min后，細(xì)胞仍可保持足夠強(qiáng)的熒光。為了保證良好的固定效果，丙酮固定最好在低溫下進(jìn)行。由于丙酮和多聚甲醛固定細(xì)胞機(jī)制不同，因此可為不同目的的實(shí)驗(yàn)研究提供選擇。

有文獻(xiàn)報(bào)道甲醇固定可保持細(xì)胞內(nèi)GFP的發(fā)光特性[2]，但一般認(rèn)為甲醇可能導(dǎo)致GFP發(fā)光強(qiáng)度的減弱[3]。李榮芳等[4]研究表明，甲醇固定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在進(jìn)行免疫組織化學(xué)過程中GFP熒光消失。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙醇在室溫或4℃時(shí)固定細(xì)胞均會(huì)導(dǎo)致GFP熒光的迅速消失，在較低的溫度下(如-20℃)用甲醇或者乙醇固定細(xì)胞可部分保留GFP的熒光特性，國(guó)外也有文獻(xiàn)報(bào)道將甲醇、乙醇單獨(dú)或者與丙酮、甲醛混合作為細(xì)胞固定劑，但除非特定的實(shí)驗(yàn)需要，建議采用多聚甲醛或丙酮固定細(xì)胞以保持GFP熒光特性。

3 結(jié)論

采用6種細(xì)胞固定劑分別在室溫和4℃條件下對(duì)表達(dá)GFP的HepG2細(xì)胞進(jìn)行固定，并對(duì)其發(fā)光特性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在室溫還是在4℃條件下，95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、Carnoy固定液固定細(xì)胞后綠色熒光迅速消失，而丙酮和4%多聚甲醛固定細(xì)胞后仍可保持足夠強(qiáng)的綠色熒光，但保留的熒光強(qiáng)度隨固定劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)和作用溫度的升高而降低。因此，對(duì)表達(dá)GFP細(xì)胞進(jìn)行固定時(shí)，宜選擇丙酮和4%多聚甲醇作為固定劑，并降低作用溫度和縮短作用時(shí)間，有利于保持細(xì)胞的綠色熒光。

[1] Mans Ehrenberg，羅文新，夏寧邵(譯).綠色熒光蛋白——發(fā)現(xiàn)、表達(dá)和發(fā)展[J].生物物理學(xué)報(bào)，2008，24(6)：422-429.

[2] Girotti M，Banting G. TGN38-green fluorescent protein hybrid proteins expressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time，invivostudy of membrane traffic pathways and suggest a possible role for ratTGN38[J].Journal of Cell Science，1996，109(12)：2915-2926.

[3] Carraway Kermit L，Carraway Coralie A Carothers. Cytoskeleton： Signalling and Cell Regulation： A Practical Approach[M].Oxford:Oxford University Press，2000：114.

[4] 李榮芳，袁慧，劉定干.甲醇固定導(dǎo)致綠色熒光蛋白的熒光消失[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，29(2)： 303-304.