小鼠內耳圓窗基因導入的實驗研究△

朱光潔 徐琳 高下 陳杰 丁小瓊 麻曉峰 陸玲 秦小明 周函 崔昕燕

小鼠內耳圓窗基因導入的實驗研究△

朱光潔1，2徐琳2高下2陳杰2丁小瓊2麻曉峰2陸玲2秦小明2周函2崔昕燕2

目的 研究攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）腺病毒（Ad－EGFP）經由小鼠耳后圓窗徑路導入內耳的可行性，分析EGFP在耳蝸內的表達特點。方法 19只健康的8～9周齡C57BL／6J雄性小鼠隨機分為三組：Ad－EGFP組7只，人工外淋巴液組6只，兩組通過耳后切口圓窗徑路注射，分別導入Ad－EGFP和人工外淋巴液；空白對照組6只，未予處理。各組均于術前3日和術后7日行聽性腦干反應（ABR）檢查；術后7日取出耳蝸于熒光顯微鏡下觀察EGFP在內耳的分布并行免疫組化觀察EGFP在基底膜的表達。結果 3組動物術前ABR反應閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），術后7日，Ad－EGFP組ABR反應閾為62.86±9.94 dB SPL，人工外淋巴液組ABR反應閾為60.83±9.70 dB SPL，均較術前（37.86±8.59和34.16± 8.04 d B SPL）及空白對照組（40.83±8.61 dB SPL）高（P值均＜0.05）；空白對照組實驗前后ABR反應閾無變化，Ad－EGFP組與人工外淋巴液組術后7天ABR反應閾差異無統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。Ad－EGFP組Ad－EGFP導入后在基底膜上可見EGFP呈廣泛表達，人工外淋巴液組和空白對照組基底膜未見熒光表達。結論 外源性基因可經內耳圓窗導入并在耳蝸基底膜上廣泛表達。

基因轉導； 圓窗； 腺病毒； 小鼠； EGFP

內耳基因治療作為感音神經性聾的新興手段目前研究廣泛，合理的手術入路及良好的動物模型是內耳基因治療能夠得以實施的研究基礎。作為經典的動物模型，豚鼠和大鼠實驗證實了內耳基因轉導技術的可行性［1，2］。小鼠作為遺傳學研究的動物模型，近年來，引起了耳科學界的關注［3～5］，如將遺傳性聾小鼠和內耳基因轉導技術良好的結合，將可能為人類遺傳性聾找到一條新的治療途徑。然而，鑒于小鼠內耳的解剖特點，怎樣將攜帶目的基因的載體成功導入體積微小的耳蝸是實驗研究中的主要難點，選擇合適的手術入路十分重要。本研究采用經圓窗鼓階顯微注射法，通過將攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的腺病毒（Ad－EGFP）經耳后入路圓窗導入，觀察腺病毒能否轉導入小鼠內耳并進行相應蛋白的表達，以期為后續(xù)的目的基因轉導遺傳性聾小鼠內耳實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶增強型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（Ad－EGFP，滴度：1×109PFU）由南京大學模式動物研究所張文程博士提供。

1.2 動物分組 健康的8～9周齡C57BL／6J小鼠19只，雄性，體重20～30 g（南京大學模式動物研究所提供）。隨機分成三組：Ad－EGFP組7只，人工外淋巴液組6只，空白對照組6只。Ad－EGFP組及人工外淋巴液組均以左耳作為手術耳，分別于術中經圓窗注入Ad－EGFP及人工外淋巴液；空白對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3 內耳圓窗基因導入方法 Ad－EGFP組和人工外淋巴組動物以三溴乙醇（2，2，2－Tribromoethanol）500 mg／kg腹腔注射麻醉，在手術顯微鏡下，沿術側耳根部外側弧形切開皮膚及皮下組織，沿肌腱剪斷胸鎖乳突肌，暴露下方二腹肌后腹和聽泡后壁。在高倍鏡下用尖鑷咬開聽泡，暴露鐙骨動脈及上方圓窗，將微量注射器內1μL Ad－EGFP重組腺病毒或人工外淋巴液經圓窗緩慢注入耳蝸，取預先備好的脂肪迅速封堵圓窗，耳腦膠覆蓋脂肪塊，分層縫合切口，37℃熱臺復蘇。

1.4 聽性腦干反應（ABR）測試 各組動物分別于術前3天和術后7天應用TDT system3（Tucker－Davis Technologies，美國）系統(tǒng)行ABR測試（均測試左耳）。測試于隔聲屏蔽室內進行，小鼠俯臥位于測試臺上，顱頂為記錄電極，測試耳為參考電極，鼻尖處接地線。刺激聲為短聲（click），疊加1 024次，濾波帶寬10～3 000 Hz，給聲范圍110 dB至0 dB終止，以給聲刺激至少能引出波I及波II并與上一波形有延續(xù)性為閾值判斷標準。

1.5 耳蝸基底膜鋪片及免疫熒光染色 于術后7天斷頸處死動物，迅速挑開聽泡，取出耳蝸，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（p H 7.4）中，在體式熒光顯微鏡下（Leica，德國）進行內耳外觀形態(tài)觀察后，于解剖顯微鏡下（Leica，德國）進行蝸頂打孔，開放圓窗及卵圓窗。4℃固定過夜，10%EDTA室溫脫鈣三天，基底膜鋪片。

基底膜鋪片標本經PBS洗后0.3%的Triton X－100破膜10分鐘。PBS洗后5%BSA封閉組織30分鐘后，加1：100稀釋兔抗鼠EGFP（Santa Cruze，美國）一抗4℃濕盒過夜。PBS洗后加1：200羊抗兔488標記二抗（Pierce，美國），室溫30分鐘，濕盒閉光。PBS洗后50%甘油磷酸鹽溶液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的分布并拍片（Leica，德國）。

1.6 統(tǒng)計學方法 各組ABR反應閾比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包中方差分析和t檢驗分析處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組術前3天及術后7天ABR反應閾 術前3天三組間ABR反應閾比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Ad－EGFP組及人工外淋巴液組術后7天與術前3天及空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ad－EGFP組與人工外淋巴液組術后7天比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組動物手術前后ABR閾值

表1 各組動物手術前后ABR閾值

注：*與同組術前3天比較，P＜0.05；△與空白對照組術后7天比較，P＜0.05

組別耳數術前3天術后7天Ad－EGFP組7 37.86±8.59 62.86±9.94*△6 40.00±7.07 40.83±8.61人工外淋巴液組6 34.16±8.04 60.83±9.70*△空白對照組

2.2 動物術后中、內耳外觀觀察 術后無動物死亡，術后7天取材時見動物中耳腔內清潔，未見中耳及內耳炎癥、出血等反應。體式熒光顯微鏡下可見Ad－EGFP組EGFP的表達部位包括內耳的圓窗、前庭窗及聽小骨、鐙骨動脈及耳蝸附近軟組織等廣泛區(qū)域；剝開耳蝸骨壁，則可見血管紋、螺旋韌帶、基底膜和骨螺旋板等部位有大量熒光表達（圖1）。人工外淋巴液組（圖2）和空白對照組雙側耳蝸則無熒光表達。

2.3 基底膜免疫熒光觀察結果 Ad－EGFP組基底膜鋪片Corti器形態(tài)良好，熒光表達部位包括從頂回到底回的支持細胞區(qū)域、骨螺旋板區(qū)域、螺旋神經節(jié)細胞等（圖3）。人工外淋巴液組和空白對照組雙側耳蝸基底膜鋪片未見EGFP表達。

3 討論

小鼠是發(fā)育、分化及疾病在基因水平研究的最主要的動物模型，與人類基因型有極高的同源性，內耳結構和功能與人類極為相似，基因打靶技術可在小鼠體內進行人類耳聾基因的研究等［6～8］，因此，小鼠作為內耳基因治療研究的模式動物，有明顯的優(yōu)點。但由于小鼠內耳的解剖結構的特殊性也使其成為困擾實驗者進行外源基因導入的瓶頸，如小鼠耳蝸體積小，外淋巴容積僅為0.6μl，限制了導入外源基因的體積；耳蝸骨壁較脆，對鉆孔技術要求高；鐙骨動脈緊貼圓窗龕下方，手術過程中易觸碰之造成大出血［4，5］。

圖1 熒光顯微鏡下Ad－EGFP組術側耳蝸大體標本 圓窗附近及頂轉均可見EGFP陽性綠色熒光信號（×16）

圖2 熒光顯微鏡下人工外淋巴液組術側耳蝸大體標本 未見EGFP陽性綠色熒光信號（×16）

圖3 激光共聚焦顯微鏡下Ad－EGFP組術側耳蝸基底膜免疫組化鋪片 基底膜上EGFP呈廣泛表達（×200）

目前，載體經外淋巴導入的途徑主要有聽泡上打孔及聽泡外途徑兩類，其中，聽泡上打孔又可分為經圓窗鼓階顯微注射、微滲透泵導入或圓窗膜上粘貼浸泡治療介質的明膠海綿三種經圓窗途徑［9，10］及耳蝸切開鼓階顯微注射、微滲透泵導入兩種途徑［11，12］；聽泡外途徑包括聽泡外鼓階顯微注射法和外半規(guī)管切開顯微注射法［13，14］。經圓窗及耳蝸切開直接注射是耳蝸轉基因載體導入的經典方法，定位確切，轉入效率高，但破壞了聽泡結構的完整性，有可能影響聲音的傳入。明膠海棉浸入脂質體及腺病毒載體貼圓窗膜法能成功地將外源基因經完整圓窗膜導入耳蝸內的許多組織中并得到表達，但也要破壞聽泡本身。經半規(guī)管和聽泡外鼓階途徑也能夠將轉基因載體成功導入并保持了聽泡的完整性，但可能會致前庭功能受損。故怎樣將攜帶目的基因的載體成功導入體積微小的小鼠內耳中并保持術后無聽力下降是實驗研究中的主要難點，選擇一條合適的手術入路十分重要。

考慮到小鼠耳蝸相對容積小，操作困難，本研究采取了經圓窗膜導入的方法，成功地將Ad－EGFP轉染至耳蝸各部位，實現了腺病毒在內耳的成功轉染，分析原因可能與實驗過程中緩慢注入約1μl腺病毒載體后迅速用脂肪封堵，有效的預防了液體外漏有關。然而，腺病毒在內耳的轉染部位卻不能人為控制，有很大的隨機性，與腺病毒在淋巴液中的運動有關，這可能需要運用更有細胞針對性的新型載體來進行實驗。

從文中結果看，術后Ad－EGFP組、人工外淋巴液組聽力均較術前有所下降（P＜0.05），兩組術后聽力比較差異無統(tǒng)計學意義?？梢姡瑘A窗膜導入方法影響了小鼠的術后聽力，其原因可能為：一是破壞圓窗膜，影響了聽骨鏈、外淋巴液機械能的傳遞與釋放，造成了傳導性聾；二是液體導入過程中對膜迷路產生的機械損傷。

目前應用于耳蝸的轉基因載體主要包括病毒類和非病毒類，其中病毒類包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒等；非病毒類有脂質體、納米材料等。非病毒載體無免疫原性，有研究證實能夠攜EGFP成功轉染內耳［15，16］，但由于其轉染效率低，不能長期表達，目前應用較少。腺病毒是轉基因研究中最常用的載體，導入效率明顯高于逆轉錄病毒，能夠制備較高滴度的病毒，且對非分裂細胞也具有很好的感染性，雖然免疫原性不可避免，但某些亞型幾無致病性。故本研究選用了腺病毒作為載體，結果顯示能夠將基因成功轉染細胞且未見明顯炎癥反應，為下一步的內耳轉基因治療打下基礎。

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（2009－11－09收稿）

（本文編輯 雷培香）

Gene DeIivery through Round Window Membrane in Mouse Inner Ear

Zhu Guangjie*，Xu Lin，Gao Xia，Cheng Jie，Ding Xiaoqiong，Ma Xiaofeng，Lu Ling，Qin Xiaomin，Zhou Han，Cui Xinyan
（*The medicaI coIIege of Southeast University，Nanjing，210009，China）

Objective To investigate the expression of enhanced green fluorescence protein（EGFP）in inner ear of mice by microinjecting through the round window membrane with adenoviral vectors.Methods 19 healthy C57BL／6J mice were selected and divided into three groups：Ad－EGFP group，artificial perilymphatic fluid group and control group.7 mice were microinjected Ad－EGFP through round window membrane，6 mice were implanted with artificial perilymphatic fluid，and the left 6 mice were maintained as controls.Auditory brainstem response（ABR）thresholds were tested in all animals three days before surgery and seven days after surgery.All animals were sacrificed and the surface preparations of basilar membrane were carried out seven days after surgery.ResuItsABR results showed that this surgery had significant side－effect on the hearing of mice，but there was no significant difference between Ad－EGFP group and artificial perilymphatic fluid group after mircoinjection.Bright green fluorescence in cochleae was observed in Ad－EGFP group while artificial perilymphatic fluid group and control group were free of fluorescence.ConcIusion The transgenic technique can successfully deliver EGFP into the inner ear by microinjection through round window membrane.

Gene transfer； Round window； Adenovirus； Mouse； EGFP

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.011

R764.9＋3

A

1006－7299（2010）04－0347－04

△ 國家自然科學基金（30973302）、江蘇省重點人才項目基金（RC2007010）、南京市醫(yī)學科技重點項目基金（ZKX06019）資助項目1 東南大學醫(yī)學院（南京 210009）； 2 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科

朱光潔，女，江蘇人，碩士研究生，研究方向：聽力學基礎研究。

高下（Email：xiagao213＠yahoo.com.cn）