耳鳴模型大鼠聽皮層生長相關(guān)蛋白－43和細胞骨架活性調(diào)節(jié)蛋白的表達*

蘇文玲 趙德安 高興強 劉慶華 魏婷婷 趙巖

耳鳴模型大鼠聽皮層生長相關(guān)蛋白－43和細胞骨架活性調(diào)節(jié)蛋白的表達*

蘇文玲1趙德安1高興強1劉慶華1魏婷婷1趙巖2

目的 檢測神經(jīng)元功能可塑性基因生長相關(guān)蛋白－43（growth associated protein，GAP－43）和細胞骨架活性調(diào)節(jié)蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）在水楊酸誘導(dǎo)耳鳴大鼠聽皮層中的表達，探討其在耳鳴產(chǎn)生中的作用。方法 將24只白色Wistar大鼠隨機分為3組：水楊酸鈉組（8只）、生理鹽水組（8只）和空白對照組（8只）。前兩組從條件反射建立前開始于每次條件反射訓(xùn)練前2小時分別腹腔注射10%水楊酸鈉溶液（350 mg／kg）和同體積生理鹽水，至實驗結(jié)束，空白對照組不做任何處理。通過行為學(xué)方法證實水楊酸鈉組動物感受到耳鳴后，利用熒光定量PCR檢測動物聽皮層中GAP－43和ARC的表達。結(jié)果 水楊酸鈉組大鼠聽皮層中GAP－43和ARC蛋白陽性神經(jīng)元的表達（分別為2.17±0.72、4.90±2.13）明顯高于生理鹽水組（分別為1.05±0.20、1.13±0.42）和空白對照組（分別為0.96±0.97、1.07±0.70）（P＜0.01），而生理鹽水組和空白對照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 耳鳴大鼠聽皮層中神經(jīng)元功能可塑性基因GAP－43和ARC蛋白陽性神經(jīng)元的表達增加，推測它們可能在耳鳴的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

耳鳴； 基因，ARC，GAP－43； 聽皮層； 水楊酸鈉

新近的研究認為，耳鳴動物聽皮層中可能發(fā)生了功能性重組［1］。細胞骨架活性調(diào)節(jié)蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）可以改變神經(jīng)元的興奮性和可塑性，并且是聽覺系統(tǒng)變化的標志之一。生長相關(guān)蛋白－43（growth associated protein－43，GAP－43）又名B－50、F1、PP46、神經(jīng)調(diào)節(jié)素，是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的結(jié)果表明，GAP－43的表達與神經(jīng)元軸突生長一致［2］。在發(fā)育成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，成熟神經(jīng)元軸突的生長和突觸的可塑性處于抑制狀態(tài)，當(dāng)軸突受到損傷后，軸突的延長和重建可被重新誘導(dǎo)，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突向外生長依賴于有關(guān)蛋白的合成，GAP－43就是表達明顯的蛋白之一，GAP－43的表達是評估軸突損傷和再生反應(yīng)的重要指標［2］。因此，GAP－43和ARC的表達水平能夠反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的變化，被普遍認為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能可塑性有關(guān)。本研究通過對GAP－43和ARC基因在耳鳴動物模型大鼠聽皮層中的表達進行研究，旨在探討耳鳴大鼠聽皮層發(fā)生的可塑性變化及其在耳鳴產(chǎn)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用2～3月齡、健康、耳廓反應(yīng)靈敏、無中耳感染、雙耳ABR反應(yīng)閾在20～30 dB SPL、體重200～300 g的Wistar大鼠24只（廈門大學(xué)實驗動物中心提供），雌雄不限。所有實驗動物均無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機（用紙袋抽簽）分為3組，每組8只：①水楊酸鈉組，從條件反射建立前開始于每次條件反射訓(xùn)練前2小時腹腔注射10%水楊酸鈉溶液（350 mg／kg），至實驗結(jié)束，制造耳鳴動物模型；②生理鹽水組，每天在相同時間段內(nèi)腹腔注射同體積生理鹽水；③空白對照組，生活于安靜環(huán)境中不限水、不注射藥物。水楊酸鈉組和生理鹽水組按照耳鳴行為學(xué)模型建立的需要，給予白噪聲刺激及條件反射訓(xùn)練，注射藥物的持續(xù)時間根據(jù)條件反射訓(xùn)練的結(jié)果而定，約10～14 d。

1.2 耳鳴動物模型的確立 參照李明［3］等創(chuàng)立的耳鳴動物模型的方法，將限制進食的動物置于有背景白噪聲的隔聲室內(nèi)進行條件反射訓(xùn)練，使動物將耳內(nèi)聲音的有無與安全與否聯(lián)系起來，形成“背景噪聲停止—進食減少或停止”的條件反射。用條件反射消退期的長短來證明動物是否感受到耳鳴，即如果動物感受到了耳鳴，那么在背景噪聲停止后動物會把耳鳴當(dāng)成部分安全信號，從而加快條件反射的消退。本實驗三組大鼠均成功建立了條件反射，水楊酸鈉組條件反射平均消退期為3.00±1.07天，生理鹽水組消退期為4.50±1.19天，空白對照組消退期為6.25±1.04天，經(jīng)單向方差分析，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明注射水楊酸鈉后大鼠確實感受到了耳鳴。

1.3 取材及熒光定量PCR測定

1.3.1 切取聽覺通路核團雙側(cè)聽皮層 最后1次注射藥物后3 h將大鼠置于封閉的裝有乙醚的干燥器內(nèi)麻醉后，于近枕骨處迅速斷頭，分離顱骨皮膚，暴露枕骨大孔，用剪刀經(jīng)枕骨大孔延顱中線將顱骨剪開，掀開顱頂兩側(cè)顱骨后，再分離左右兩側(cè)顱骨，即可完整暴露大鼠腦組織。最后離斷入顱神經(jīng)，游離出腦組織。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜切取含聽皮層的腦組織，并浸于存有RNAstore樣本保存液的EP管中。將標本當(dāng)天在4℃條件下過夜?jié)B透，第二天轉(zhuǎn)存于－80℃保存。

1.3.2 熒光定量－PCR測定

1.3.2.1 引物與探針的設(shè)計與合成 所有引物根據(jù)Genbank的登錄號，查找m RNA序列，利用NCBI primer designing tool工具在線設(shè)計，由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物與探針的設(shè)計與合成

1.3.2.2 RNA完整性和純度鑒定 利用試劑盒提取總RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，從圖譜上可見18S和28S兩條清晰條帶（圖1），說明總RNA完整性較好。以紫外分光光度法檢測其在260、280 nm的吸光度值，計算OD260／OD280的比值鑒定RNA純度，所有樣品的OD260／OD280比值均在1.7～2.0之間，說明純度較高，完全能夠滿足后續(xù)實驗研究需要。

1.3.2.3 樣品處理、紫外分光光度法測定提取RNA的含量，采有TAKARA試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄及RT－PCR等，詳細步驟嚴格按照說明書進行。

1.4 結(jié)果判斷與統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗采用相對定量分析基因表達情況，采用GAPDH作為管家基因，基因表達結(jié)果以靶標基因與管家基因的比值表示。反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線分析，確定引物擴增特異性和擴增效率。所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計，各組動物聽皮層中GAP－43和ARC熒光定量PCR的表達，均數(shù)間的兩兩比較采用最小顯著性t檢驗。

圖1 總RNA電泳圖

2 結(jié)果

2.1 本實驗以GAPDH作為管家基因進行基因相對定量表達分析 GAPDH、ARC和GAP－43三者的溶解曲線和擴增曲線都是單一的峰，說明引物擴增的特異性非常好。

2.2 各組大鼠聽皮層中GAP－43和ARC表達結(jié)果見表2，可見，水楊酸鈉組大鼠聽皮層中GAP－43和ARC蛋白陽性神經(jīng)元的表達明顯高于生理鹽水組和空白對照組（P＜0.01），而生理鹽水組和空白對照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠GAP－43和ARC熒光定量PCR表達

表2 各組大鼠GAP－43和ARC熒光定量PCR表達

注：*與其他兩組比較，P＜0.01

GAP－43 ARC水楊酸鈉組8 2.17±0.72*4.90±2.13組別n * 8 0.96±0.97 1.07±0.70生理鹽水組8 1.05±0.20 1.13±0.42空白對照組

3 討論

3.1 耳鳴和聽皮層可塑性的關(guān)系 以往認為，耳鳴的病變部位主要位于聽系末梢器官，實際上，不論耳鳴產(chǎn)生于外周還是中樞，異常信號必須上傳到大腦皮層才能被感知為耳鳴，即聽覺中樞特別是大腦皮層參與了耳鳴的產(chǎn)生與維持［1］。近來腦功能成像研究證明，耳鳴患者的顳葉聽皮層存在高代謝活動或局部腦血流增加，提示大腦皮層可能有異常的改變［1］。耳鳴的感覺會增加聽皮層的活動，對水楊酸鈉注射后大鼠大腦的掃描發(fā)現(xiàn)，中樞聽覺通路的活動性發(fā)生了改變，與對照組比較，在腦干和中腦活動性水平減少，而聽覺皮層的活動性增加。這種興奮性的持續(xù)存在，可能導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)元發(fā)生改變［4］。

3.2 GAP－43在耳鳴大鼠聽皮層的表達 GAP－43廣泛分布于大腦、小腦、海馬以及脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和自主神經(jīng)系統(tǒng)。體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的結(jié)果表明，GAP－43的表達與神經(jīng)元的發(fā)育和可塑性有直接關(guān)系。研究表明，GAP－43是一種特異性的與神經(jīng)細胞生長、發(fā)育和再生過程相關(guān)的蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有較高水平的表達，尤其在生長錐處濃度很高，因而被認為參與了軸突的生長和突觸的形成［5］。在軸突的可塑性的作用表現(xiàn)在誘導(dǎo)生長錐而不是支持軸突的延長，表明GAP－43是一個重要誘導(dǎo)軸突生長的促進分子［6］。GAP－43在體內(nèi)外均短暫存在于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的未成熟的少突膠質(zhì)細胞，在外周神經(jīng)系統(tǒng)中存在于雪旺細胞前體、無髓鞘雪旺細胞。GAP－43表達于II型膠質(zhì)細胞（星形膠質(zhì)細胞）和一些反應(yīng)性膠質(zhì)細胞，而不表達于I型膠質(zhì)細胞（扁平的原生質(zhì)性星形細胞），說明GAP－43在中樞和外周的的神經(jīng)可塑性中發(fā)揮重要作用［7］。本實驗中水楊酸鈉組大鼠聽皮層中GAP－43蛋白陽性神經(jīng)元的表達明顯高于生理鹽水組和空白對照組，而生理鹽水組和空白對照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明水楊酸鈉組大鼠聽皮層產(chǎn)生了新的連接，形成新的結(jié)構(gòu)，這為大鼠耳鳴的維持起到了關(guān)鍵作用。

3.3 ARC在大鼠聽皮層的表達 ARC是一種可被不同形式的神經(jīng)活性迅速誘導(dǎo)的即刻早期基因，其表達不需要其他基因的轉(zhuǎn)錄，類似于效應(yīng)基因。它的mRNA轉(zhuǎn)運到樹突，在突觸活性位點選擇性地聚集。這個過程依賴于NMDA（N－甲基－d－天門冬氨酸，N－methyl－D－aspartic acid）受體的活化，并且會被NMDA受體對抗物所阻礙［4］。突觸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進行信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其在結(jié)構(gòu)及功能方面的可變性稱為突觸可塑性。突觸可塑性與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷后的修復(fù)以及學(xué)習(xí)記憶等重要腦功能的完成密切相關(guān)，而在條件刺激下誘發(fā)的突觸傳遞功能的長時程改變，即長時程增強（long－term potentiation，LTP）和長時程壓抑（longterm depression，LTD），是突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式。ARC的翻譯發(fā)生在突觸后致密區(qū)的多核糖體復(fù)合物內(nèi)，其所編碼的蛋白對樹突構(gòu)型及突觸功能有一定的作用。新合成的ARC的m RNA迅速移至樹突，并會選擇性積聚在被激活的突觸部位，這種機制確保了ARC蛋白定位的樹突區(qū)域已經(jīng)接受了強的可塑性活性［8］。ARC的蛋白在神經(jīng)可塑性中具有多重功能，可以影響突觸的LTP和LTD以及突觸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定可塑性。ARC的表達已經(jīng)成為整個大腦神經(jīng)元活性的一種標記。本實驗中ARC蛋白陽性神經(jīng)元在各組大鼠聽皮層中均有不同程度的表達，水楊酸鈉組表達明顯高于生理鹽水組和空白對照組，而生理鹽水組和空白對照組比較沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，說明注射水楊酸鈉造成的耳鳴引起了大鼠聽皮層中活動性增加，ARC蛋白神經(jīng)元的表達明顯增加說明ARC蛋白參與了耳鳴大鼠聽皮層的重塑。而在行為試驗研究發(fā)現(xiàn)，ARC能夠維持長程增強效應(yīng)和鞏固長程空間記憶，推測ARC可能是持久改變的標記［4］。因此說明，ARC蛋白參與了耳鳴大鼠聽皮層的重塑，對耳鳴的維持起到重要作用。

注射水楊酸鈉可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生耳鳴的可能原因很多，而聽皮層神經(jīng)元可塑性變化與耳鳴的產(chǎn)生和維持存在密切關(guān)系。在水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴大鼠的聽皮層中，GAP－43和ARC的表達明顯升高，說明聽皮層的神經(jīng)元可能發(fā)生了重塑，提示耳鳴與聽皮層神經(jīng)元的重塑密切相關(guān)，為耳鳴的中樞發(fā)生機制提供了一個理論依據(jù)。

1 王洪田，田嘉禾，尹大一，等，耳鳴相關(guān)腦區(qū)的正電子發(fā)射斷層成像［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2000，35：420.

2 Kawasaki T，Nishio T，Kawaguchi S，et al.Spatiotemporal distribution of GAP－43 in the developing rat spinal cord：A histological and quantitative immunofluorescence study［J］.Neurosci Res，2001，39：347.

3 李明，楊光，關(guān)穎，等.耳鳴動物行為模型的制作［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2003，11：108.

4 Mahlke C，Wallh?usser－Franke E.Evidence for tinnitus－related plasticity in the auditory and limbic system，demonstrated by arg3.1 and c－fos immunocytochemistry［J］.Hear Res，2004，195：17.

5 許建中，李起鴻.生長相關(guān)蛋白－43與周圍神經(jīng)損傷及再生［J］.中華創(chuàng)傷雜志，1999，15：391.

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7 Sensenbrenner M，Lucas M，Deloulme JC.Expression of two neuronal markers，growth－associated protein 43 and neuron－specific enolase，in rat glial cells［J］.J Mol Med，1997，75：653.

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（2009－09－24收稿）

（本文編輯 雷培香）

Expression of GAP－43 and ARC in the Auditory Cortex of Rats Experiencing Tinnitus

Su WenIing，Zhao De＇an，Gao Xingqiang，Liu Qinghua，Wei Tingting，Zhao Yan
（Department of OtorhinoIaryngoIogy－Head＆Neck Surgery，The First AffiIiated HospitaI of Xiamen University，Xiamen，361003，China）

Objective To investigate the expression and the possible role of GAP－43（growth associated protein，GAP－43）and ARC（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）in the auditory cortex of rats which experienced tinnitus.Methods Twenty－four white Wistar rats were randomly distributed into 3 groups：sodium salicylate group（n＝8），physiological saline group（n＝8）and the control group（n＝8）.Tinnitus was induced by salicylate administration and evaluated by behavioral conditioning techniques，and fluorescence quantitative PCR was used to observe the expression of GAP－43 and ARC in the auditory cortex in each group.ResuIts GAP－43 and ARC positive neurons were observed in all rats.The expression of GAP－43 and ARC in the sodium salicylate group was significantly higher than that of other two groups（P＜0.01）.ConcIusion The higher expression of GAP－43 and ARC in the auditory cortex of rats experiencing tinnitus suggests their important roles in the mechanism of tinnitus.

Tinnitus； Genes，GAP－43 and ARC； Auditory cortex； Sodium salicylate

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.03

R339.16

A

1006－7299（2010）04－0320－04

* 廈門市科技局資助項目（3502z20064017）

1 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科（廈門 361003）；

2 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室

蘇文玲，女，福建人，副主任醫(yī)師，研究方向為耳顯微外科、耳神經(jīng)外科基礎(chǔ)及臨床研究。

趙德安（Email：zhaoda＠263.net）； 高興強（Email：xingqiang7211＠yahoo.com.cn）