水體硝化菌劑保存方法的研究

， ，

(1.遼寧石油化工大學環(huán)境與生物工程學院，遼寧 撫順 113001；2.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001)

菌種保藏的主要目的在于能在較長時間內(nèi)保持菌種的生存，保持菌種在遺傳、形態(tài)和生理上的穩(wěn)定性[6]。同時，還要保持菌種的物種獨立性，使其免受其它微生物的侵染，保持純培養(yǎng)狀態(tài)[7]。其原理主要是根據(jù)微生物的生理、生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降至最低程度或處于休眠狀態(tài)，使菌株很少發(fā)生突變，以達到保持純種的目的[8]。

菌種保存的方法有很多，如斜面保存、液體石蠟保存、冷凍干燥保存、液氮超低溫保存、干燥保存等等。由于硝化菌的降解能力和保藏能力是影響其商品化的兩個重要因素[9]，所以本實驗旨在尋找硝化菌的最佳保存方法。

1 實驗

1.1 儀器

可見分光光度計,韓國新科儀器制造公司;恒溫水浴鍋,北京順杰欣隆科技有限公司;電子分析天平,德國天平儀器公司。

1.2 硝化作用原理

在好氧條件下，通過亞硝化菌和硝化菌的作用，將氨氮氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程,稱為生物硝化作用。生物硝化的反應過程為：

由上式可知:(1) 在硝化過程中，1 g氨氮轉化為硝酸鹽氮時需氧4.57 g；(2)硝化過程中釋放出H+，將消耗廢水中的堿度，每氧化1 g氨氮，將消耗堿度(以CaCO3計)7.1 g。

影響硝化過程的主要因素有：(1)pH值，當pH值為8.0～8.4時(20℃)，硝化作用速度最快。硝化過程中pH值在7.5以上。(2)溫度，溫度高時硝化速度快。亞硝化菌的最適宜水溫為35℃，在15℃以下其活性急劇降低，故水溫不宜低于15℃。

1.3 硝化活性評價培養(yǎng)基(NBM，氨氮濃度150 mg·L-1)

培養(yǎng)基組成：(NH4)2SO42.1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，CaCl20.3 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1， FeSO417 mg·L-1，EDTA 8 mg·L-1。

1.4 氨氮濃度的測定

氨氮濃度測定采用納氏比色法，參照GB/T 7479-1987。

1.5 比硝化活性(NA)的測定

比硝化活性(NA， g·kg-1·h-1)定義為單位質(zhì)量(kg)硝化菌在單位時間(h)內(nèi)消耗的氨氮質(zhì)量(g)。

取1 g新鮮培養(yǎng)或保存后的硝化菌群濃縮液接種于300 mL NBM培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，反應器有效體積為500 mL，氣升式攪拌，通氣量為2 L·min-1，分別在接種前和培養(yǎng)48 h后測定反應體系中的氨氮濃度( mg·L-1)，記為c0和c1，按式(1)計算NA。

(1)

1.6 硝化活性保持率(RNA)的測定

RNA指保存后硝化菌的硝化活性(NA1)占新培養(yǎng)硝化菌的硝化活性(NA0)的百分比，見式(2)。

(2)

2 結果與討論

2.1 氨氮濃度標準曲線

按照GB/T7479-1987方法測定反應液的OD值，以氨氮濃度(ca， mg·L-1)為橫坐標、吸光度(OD)值為縱坐標繪制標準曲線，見圖1，擬合回歸方程為OD=4.957ca-0.011。

圖1 OD值與氨氮濃度之間的關系

2.2 室溫保存的硝化菌活性考察

取新鮮培養(yǎng)和室溫保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結果見圖2。

圖2 硝化菌活性隨室溫保存時間變化趨勢

從圖2可知，隨著保存時間的延長，硝化菌的活性急劇下降，新鮮培養(yǎng)和室溫保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.46、0.38、0.25、0.19、0.03，平均每天降低0.0101 g·kg-1·h-1，半衰期為22.45 d。

由于在常溫下保存硝化菌的活性沒有受到抑制，而且硝化菌在保存之前經(jīng)過濃縮，菌體的密度相對較高，導致了在保存過程中隨著時間延長，硝化菌嚴重缺氧致死。另外，由于實驗室培養(yǎng)的硝化菌并非純的自養(yǎng)硝化菌，而是一個以自養(yǎng)硝化菌占優(yōu)勢的菌群，菌群中還存在少量反硝化菌。反硝化菌比較適合在無氧的條件下生長，而且屬于異養(yǎng)菌，生長時需要碳源，因此在保存過程中隨著體系中的氧氣消耗殆盡，反硝化菌對死掉的硝化菌起到了腐敗的作用，所以在室溫保存一個月左右的時候，整個保存體系會逐漸變黑，而且氣味發(fā)臭，這也是進一步加速菌群硝化活性降低的原因之一。 由此可見，室溫保藏硝化菌的方法只適合硝化菌的短期保存。

2.3 不同溫度保存的硝化菌活性考察

由于室溫僅適合短期保存硝化菌，因此考察了其它溫度條件下保存硝化菌的活性。取新培養(yǎng)和分別在4℃、20℃、30℃、35℃條件下保存28 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，計算硝化活性保持率，結果見圖3。

圖3 不同溫度保存的硝化菌活性保持率

從圖3可知，4℃、20℃、30℃和35℃保存28 d的硝化菌的活性保持率分別為58.59%、52.97%、34.89%和8.63%。由此可見，在不結冰的前提下，20℃以下保存硝化菌活性相對損失較小，20℃以上則不利于長期保存，4℃條件最好。任杰等[9]研究發(fā)現(xiàn)在不同溫度下保存的硝化菌隨著保藏溫度的升高，其衰弱指數(shù)逐漸增大，半衰期逐漸縮短，這與本實驗的結果相符。

2.4 4℃冷藏的硝化細菌活性考察

取新培養(yǎng)和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結果見圖4。

圖4 硝化菌活性隨4℃保存時間變化趨勢

從圖4可知，隨著保存時間的延長，硝化菌的活性逐漸下降，但是與室溫保存相比，活性下降的速率較慢。新培養(yǎng)和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群濃縮液的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.46、0.27、0.18、0.10和0.02，半衰期為36.68 d。

由于硝化菌在4℃條件下代謝活動降低或接近于停止，維持生命所需的氧氣較少或甚至不需要，而且反硝化菌等雜菌在這種條件下不能生長，因此4℃條件保存時間比室溫更長，比較適合用于硝化菌的中期(1～2個月)保存。

2.5 加培養(yǎng)基保存的硝化菌活性考察

考察了保存體系中加入NBM培養(yǎng)基對保持硝化菌活性的影響，取新培養(yǎng)和在4℃與室溫條件下加培養(yǎng)基或不加培養(yǎng)基保存28 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，計算硝化活性保持率，結果見圖5。

圖5 保存體系加培養(yǎng)基對保持硝化菌活性的影響

從圖5可知，無論室溫或4℃保存，體系中加入NBM培養(yǎng)基都有利于硝化活性的保持。室溫下未加培養(yǎng)基、室溫下加培養(yǎng)基、4℃未加培養(yǎng)基和4℃加培養(yǎng)基保存28 d的硝化菌群的硝化活性保持率分別為40.32%、55.94%、58.59%和67.23%。可見加培養(yǎng)基后，室溫和4℃保存的活性保持率分別提高了15.62%和8.64%。因此可以推測，加培養(yǎng)基后室溫和4℃保存的半衰期將分別向后推遲15.62%和8.64%。加培養(yǎng)基比不加培養(yǎng)基能保持更多的硝化活性，是因為培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分為硝化菌提供了代謝所需的必要物質(zhì)保障，而加培養(yǎng)基條件下常溫保存和4℃保存相比，硝化活性保持率提高得更多(分別為15.62%和8.64%)，這可能是因為常溫條件下硝化菌的代謝活動遠遠大于4℃條件所致。

2.6 -20℃凍存的硝化細菌活性考察

2.6.1 選擇凍存保護劑

考察了甘油和二甲基亞砜(DMSO)為保護劑凍存硝化菌群保持活性的效果。甘油和DMSO加入量(質(zhì)量比)為10%，保存溫度為-20℃，保存時間為28 d。取新培養(yǎng)和保存后的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結果見圖6。

圖6 甘油和DMSO為保護劑對凍存后硝化菌活性的影響

從圖6可看出，以甘油或DMSO為保護劑，-20℃條件凍存28 d后，比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.45和0.42，比新培養(yǎng)的硝化菌群分別僅降低2.2%和8.7%?？梢姡视秃虳MSO作為保護劑都能保持硝化菌的活性，其中甘油效果更好。甘油和DMSO能作為硝化菌群凍存保護劑的原因可能是因為它們可以滲透到細胞內(nèi)，使得細胞脫水而保護細胞不被凍裂。

2.6.2 硝化活性隨凍存時間變化的趨勢

以甘油為保護劑，-20℃條件凍存的硝化菌群分別于1、4、8、12、18、24和36個月后取樣分析其硝化活性，見圖7。

NA=0.4533 e-0.0213t

(3)

圖7 硝化活性隨凍存時間變化的趨勢

從圖7可知，隨著凍存時間的延長，硝化活性呈遞減趨勢[式(3)]，但與室溫和4℃保存的硝化細菌活性相比，降低的速率相對較慢，其半衰期為31.85個月，約955.5 d。由于保護劑甘油的存在使得硝化菌在結凍時免于因細胞內(nèi)水分結冰造成細胞裂解，同時又因為處在-20℃的低溫環(huán)境，細胞停止了一切代謝活動，不會因為細胞密度、營養(yǎng)等因素而導致細胞死亡，能夠很好地保持硝化菌的生命特征，從而維持其硝化活性。因此，相比室溫和4℃保存，-20℃凍存適合于硝化菌的長期(2～3年)保存。

3 結論

通過對不同溫度以及加入培養(yǎng)基和保護劑等條件下保存后的硝化菌活性進行分析，得到3種合適的硝化菌保存方法，分別為：

(1)室溫保存的硝化活性半衰期為22.45 d，適合硝化菌的短期保存。保存體系中加入NBM培養(yǎng)基能夠延長半衰期15.62%，即達到28.71 d。

(2)4℃保存的硝化活性半衰期為36.68 d，適合硝化菌的中期保存。保存體系中加入NBM培養(yǎng)基能夠延長半衰期8.64%，即達到39.83 d。

(3)以甘油為保護劑，-20℃保存的硝化活性半衰期為955.5 d，適合硝化菌的長期保存。

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